179600. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a C-15003 P-3-antibiotikum előállítására
15 179600 10 oltóanyag eredeti térfogatának megfelelő térfogatú sterilizált desztillált vízben újraszuszpendáljuk. Az így kapott oltóanyagból ezután egy térfogatrésszel beoltunk 40 térfogatrész olyan fő táptalajt, amely 3% oldható keményítőt, 0,2'/ ammónium-kloridot, 0,05% magnézium-szulfátot, 1,09% kálium-dihidrogén-foszfátot, 2,09% kálium-hidrogén-foszfátot. 0,001% vas(II)-szulfátot és 0,1% L-valint tartalmaz. Az így kapott fő tenyészetet ezután 28 °C-on 8 napon át 200 fordulat/perc fordulatszámú forgó rázógépen rázatjuk. A C- 1 5003 antibiotikumok termelt összmennyisége 16Mg/ml. ezen belül az antibiotikumok összmennyiségére vonatkoztatva a P-3 antibiotikum aránya 95 súly%. 2. példa Az 1. példában ismertetett oltótenyészetből 500 térfogatrészt bemérünk egy 2000 törfogatrész. űrtartalmú Sakaguchi-lombikba, majd 28 °C-on 48 órán át lengő rázógcpen (percenként 110 ütemet tartva) tenyésztést végzünk oltóanyagot kapva. Ezt az oltóanyagot ezután rozsdamentes acélból készült, 200 000 térfogatrész. űrtartalmú fermentorban 100 000 térfogatrész olyan táptalajhoz adjuk, amely 2.0% glükózt, 3.0% oldható keményítőt. 1.0% kukoricalekvárt, 1,0% szójabablisztet, 0,5% Polypepton márkanevű anyagot (a Daigo Nitritive Chemicals, Ltd. japán cég terméke), 0,3% nátrium-kloridot és 0,5% kalcium-karbonátot tartalmaz, illetve pH-ja 7,0. A tenyésztést 28 °C-on 48 órán át 100 liter/perc nagyságrendű levegőztetés és 200 fordulat/perc fordulatszámú keverés mellett végezzük. A kapott fermentlét ezután teljes mennyiségében hozzáadjuk egy ugyancsak 200 000 térfogatrész űrméretű, rozsdamentes acélból készült fermentorban 100 000 térfogatrész olyan fermentációs közeghez, amely 5% dext rint, 3% kukoricalekvárt, 0,1% peptont, 0,3% L-valint és 0.5% kalcium-karbonátot tartalmaz, illetve pH-ja 7.0. A fermentálást 28 °C-on 4 napon át 100 liter/perc nagyságrendű levegőztetés és 150 fordulat/perc fordulatszámú keverés mellett végezzük. A C- 15003 antibiotikumok össztermelése 12/ug/ml, ezen belül az antibiotikumok összmennyiségére vonatkoztatva a P—3 antibiotikum mennyisége mintegy 98 súly%. 3. példa A 2. példa szerint előállított fermentléből 95 000 térfogatrészhez 50 000 térfogatrész acetont adunk, majd az így kapott elegyet 30 percen át keverjük. Az elegyhez ezután 2000 súlyrész Hyflo Super-Cel márkanevű anyagot (a Johnes and Manville Products, Ltd. cég terméke) adunk, majd az így kapott keveréket alaposan keveijük. A keveréket ezután nyomószűrőn átszűrjük 135 000 térfogatrész szűrletet kapva. A szűrlethez 50 000 térfogatrész vizet és 90 000 térfogatrész etil-acetátot adunk, majd az így kapott elegyet keverés után kétszer extraháljuk. A kapott etil-acetátos fá8 zisok mindegyikét 80 000 térfogatrész vízzel mossuk, majd a fázisokat összeöntjük, 1000 súlyrész vízmentes nátrium-szulfát fölött szárítjuk, szűrjük és 200 térfogatrészre bepároljuk. A koncentrátumhoz petrolétert adunk, majd a kivált csapadékot kiszűrjük 35 súlyrész nyers terméket kapva. Az így kapott nyers termékhez ezután 50 térfogatrész etil-acetátot adunk, majd a kapott keveréket keverjük. Az oldhatatlan részt ezután kiszűrjük, a szűrlethez pedig 10 súlyrész mennyiségben a Merck német szövetségi köztársaságbeli cég által gyártott. 0.05-0,2 mm szemcseméretü szilikagélt adunk. Keverés után az etil-acetátot csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, a maradékot pedig felvisszük szilikagélből készült, 500 térfogatrész űrtartalmú kromatográfiás oszlop tetejére. Az antibiotikumokat ezután szakaszos eluálással különítjük el, az eluálást egymás után 500 térfogatrész n-hexánnal, n-hexán és etil-acetát • 3 : 1 arányú elegyéből 500 térfogatrésszel, n-hexán és etil-acetát 1 : 1 arányú elegyéből 2000 térfogatrésszel és 2000 térfogatrész, vízzel telített etil-acetáttal végezve, és 50- 50 ml térfogatrész nagyságú frakciókat szedve. Mindegyik frakcióból 1 térfogatrészt szárazra párolunk, majd a maradékhoz 0,1 térfogatrész etil-acetátot adunk és az így kapott keverékek mindegyikét a Merck német szövetségi köztársaságbeli cég által gyártott 60F2s4 jelzésű, 0.25 mm vastag és 20 • 20 cm méretű, szilikagéllel bevont üveglemez alapvonalától 2,5 cm-re odacsöppentjük, ezután pedig mintegy 17 cm hosszan vízzel telített etil-acetáttal futtatást végzünk. Futtatás után ibolyántúli fénnyel (2357 A) végezzük a detektálást. Az Rf = 0.42 értékű aktív frakciókat összegyűjtjük, majd csökkentett nyomáson 2 térfogatrésznyire bepároljuk. Ehhez a koncentrátumhoz 20 térfogatrész petrolétert adunk, amikor 9,1 súlyrész nyers kristály különíthető el. A nyers kristályokat 20 térfogatrész meleg etil-acetátban oldjuk, majd a kapott oldatból lehűtése után 0,85 súlyrész P—3 antibiotikumot különítünk el. A P—3 kristályok tisztasága 97súly%, olvadáspontja 189- -190 °C. 4. példa 400 térfogatrész 50% metanolt tartalmazó vizes elegyben feloldunk a 3. példa szerint előállított nyers termékből 20 súlyrészt. 1000 térfogatrész Diaion HP-10 gyantát (gyártja a Mitsubishi Industries Ltd. japán cég) 3000 térfogatrész 50% metanolt tartalmazó vizes eleggyel 2,5 cm átmérőjű oszlopba töltünk, majd a tisztítandó termék oldatát az oszlopon átbocsátjuk, és 1000 térfogatrész 60% metanolt tartalmazó vizes eleggyel az oszlopot mossuk. Ezután gradiens-eluálást végzünk és 7500 térfogatrész 60% metanolt tartalmazó vizes elegy és 7500 térfogatrész 95% metanolt tartalmazó vizes elegy alkalmazásával. 75 térfogatrész nagyságú frakciókat szedünk, majd minden egyes frakciót a 3. példában ismertetett módon szilikagél lemezen vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatnak vetünk alá. A 182-190. aktív frakciókat összeöntjük, majd bepároljuk. A maradékhoz 500 térfogatrész vizet és 1000 térfogatrész etil-acetátot adunk, majd az így kac It 1e 2i 3<; 35 40 45 50 55 60 65 \
