179600. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a C-15003 P-3-antibiotikum előállítására
9 179600 10 0.001# vas(II)-szulfátot és találmány szerinti adalékanyagot tartalmaz), illetve egy (II) táptalajt (amely 5% dextrint, 3# kukoricalekvárt, 0,1% peptont, 0,5% kalcium-karbonátot és találmány szerinti adalékanyagot tartalmaz), majd 28 °C-on 144 órán át 200 5 fordulat/perc sebességű forgó rázógépen vagy fermentorban tenyésztést végzünk. A4, és az 5. táblázatban megadjuk az (I) táptalajjal. illetve a (II) táptalajjal kapott eredményeket. A C-15003 antibiotikumok összhatását papírko- 10 rangos módszerrel, a meghatározásra szolgáló mikroorganizmusként Talaromyces avellaneus IFO 7721 törzset használva határozzuk meg. A meghatározáshoz használt táptalaj 3,5 g nátrium-hidrogén-foszfátból, 0,5 g kálium-dihidrogén-foszfátból, 5 g élesz- 15 tőkivonatból (a Difco amerikai egyesült államokbeli cég terméke). 10 g glükózból, 15 g agar-agarból és 1000 ml desztillált vízből (pH-ja 7,0) áll. A fermentlében összegyűlt P—2, P—3 és P—4 antibiotikumok meghatározását az alábbiakban ismerte- 20 tett módon végezzük: A fermentlét azonos térfogatmennyiségű etil-acetáttal extraháljuk, majd az extraktumot betöményítjük és szárítjuk. A megszárított maradékot olyan mennyiségű etil-acetátban oldjuk, hogy a kapott oldat ~5 térfogata a fermentlé térfogatának egy százada legyen. Az így kapott oldatot ezután a Merck nyugatnémet cég által szállított, 60F254 jelzésű szilikagél vékonyrétegkromatográfiás lemezre visszük fel, majd vízzel telített etil-acetáttal futtatást végzünk. Az anti- 30 biotikum mennyiségét és a komponensek arányát a Shimazu japán cég által gyártott CS—910 jelzésű, két hullámhosszos vékonyrétegkromatogram kiértékelő berendezéssel (videodenzitométerrel) állapítjuk meg, minden egyes folt integráldenzitása alapján 254 nano- 25 méternél. A P—2, P—3 és P—4 komponensek arányát összmennyiségükre vonatkoztatva súly%-ban adjuk meg. A 4. és 5. táblázatból látható, hogy a C-15003 törzs a P—3 antibiotikumot az antibiotikumok 40 összmennyiségére vonatkoztatva legalább 90 súly% mennyiségben termeli a találmány értelmében alkalmazott adalékanyag jelenlétében, az utóbbi nélkül peri g a P—3 súly#-os mennyisége mindössze 65 vagy még ennél is kevesebb. így a fermentléből a P—3 elkülönítése jóval hatásosabb a találmány szerinti adalékanyag alkalmazása esetén, mint anélkül. Tekintettel arra, hogy a fermentlében így képződő P-3 antibiotikum egy lipofil semleges anyag, könynyen elkülöníthető a fermentléből olyan elkülönítési ér. tisztítási módszerekkel, amilyeneket ilyen típusú mikrobiális metabolitok, azaz anyagcseretermékek elkilönítésére rendszerint használunk. így például a P-3 antibiotikum a szűrt fermentléből könnyen extrthálható vízzel nem elegyedő szerves oldószerekkel, így zsírsavészterekkel (például etil- vagy amil-acetéttal), alkoholokkal (például kloroformmal) és ketonokkal (például metil-izobutil-ketonnal). A P-3 antibiotikum extrahálását a szűrt fermentléből közel semleges pH-n, előnyösen 7-es pH-n etil-acetáttal végezzük. Az extraktumot vízzel mossuk, majd csökkentett nyomáson bepároljuk. A maradékhoz egy apoláris oldószert, például petrolétert vagy hexánt adunk, majd az aktív vegyületet tartalmazó nyers terméket csapadékként elkülönítjük. A nyers terméket ezután kívánt esetben szokásos tisztítási műveleteknek vetjük alá. E célra rutinjellegű tisztítási módszerként például adszorpciós kromatografálást végezhetünk, adszorbensként szokásos módon például szilikcgélt, aktív alumínium-oxidot vagy egy marópórusos nem-ionos gyantát használva. A nyers termékből teliét a P—3 antibiotikumot például szilikagélen végzett kromatografálással különíthetjük el, a futtatást például petroléter és hexán elegyével végezve, majd az el látáshoz egy poláris oldószert, például etil-acetátot, acetont, ctanolt vagy metanolt, vagy pedig egy poláris ollószert, például metanolt vagy etanolt vagy egy ketont, például acetont vagy metil-etil-ketont tartalmazó halogénezett szénhidrogént, például diklór-metáit.vagy kloroformot használva. Így tehát a P—3 antibiotikumot eluáljuk, szeparáljuk és kinyerjük. Ha a P- 3 antibiotikum tisztítására egy makropórusos adszorbeáló gyantát használunk, akkor a P-3 antibiotikumnak az oszlopból való eluálását víz és egy rö ddszénláncú alkohol, rövidszénláncú keton vagy egy észter elegyével végezzük. Rövidszénláncú alko-4. táblázat Adalékanyag Adalékanyag mennyisége (%) Adagolási időpont (óra)' L-valin 0,1 0 Lr valin 0,3 0 L-valin 0,1 72 D-valin 0,1 0 nátrium-izobutirát 0,01 0 Komponensek aránya (súly#,) összhatás (/Jg/ml) P—2 P-3 P—4 10 65 25 10 1 95 4 16 1 97 2 26 2 95 3 10 2 95 3 16 1 91 8 8 5
