179599. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a C-15003 P-4 antibiotikum előállítására
9 179$?Ç> 10 törzset használva határozzuk meg. A meghatározáshoz használt táptalaj 3,5 g nátrium-hidrogén-foszfátból, 0,5 g kálium-dihidrogén-foszfátból, 5 g élesztőkivonatból (a Difco amerikai egyesült államokbeli cég terméke), 10 g glükózból, 15 g agar-agárból és 5 1000 ml desztillált vízből (pH-ja 7,0) áll. A fermentlében összegyűlt P—2, P—3 és P—4 antibiotikumok meghatározását az alábbiakban ismertetett módon végezzük: 10 A fermentlét azonos térfogat mennyiségű etil-acetáttal extraháljuk, majd az extraktumot betöményítjük és szárítjuk. A megszárított maradékot olyan mennyiségű etil-acetátban oldjuk, hogy a kapott oldat térfogata a fermentlé térfogatának egy százada le- 15 gyen. Az így kapott oldatot ezután a Merck nyugatnémet cég által szállított, 60F254 jelzésű szilikagél vékonyrétegkromatográfiás lemezre visszük fel, majd 'ízzel telített etil-acetáttal futtatást végzünk. Az antibiotikum mennyiségét és a komponensek arányát a Shimazu japán cég által gyártott CS—910 jelzésű, két hullámhosszos vékonyrétegkromatogram kiértékelő berendezéssel (videodenzitométerrel) állapítjuk meg, minden egyes folt integrál-denzitása alapján 254 nanométernél. A P-2, P-3 és P—4 komponensek arányát összmennyiségükre vonatkoztatva súly%-ban adjuk meg. A 4. és 5. táblázatból látható, hogy a C—15003 törzs a P—4 antibiotikumot az antibiotikumok összmennyiségére vonatkoztatva 65—84 súly% menyryiségben termeli a találmány értelmében alkalmazott adalékanyag jelenlétében, az utóbbi nélkül pedig a P-4 súly%-os mennyisége mindössze 25 vagy még ennél is kevesebb. így a fermentléből a P—4 elkülönítése jóval hatásosabb a találmány szerinti adalékanyag alkalmazása esetén, mint anélkül. 4. táblázat Komponensek aránya Adalékanyag Adalékanyag mennyisége (%) Adagolási időpont (óra)1 P-2 (súly%) P-3 P-4 összhatás [Mg/ml] _ 10 65 25 10 L-leucin 0,1 0 5 28 67 13,5 L-leucin 0,3 0 8 13 79 11,5 L-leucin 0,1 72 5 30 65 10 5. táblázat Adalékanyag Adagolási Komponensek aránya (súly%) összhatás Adalékanyag mennyisége időpont Ifíg/mll (%) (óra)1 P-2 P-3 P-4 _ _ 15 60 25 18 L-leucin 0,3 0 7 21 72 20 L-leucin 0,5 0 5 11 84 15 1. „o” idő idő azt jelenti, hogy a kiindulási táptalaj már tartalmazta az adalékanyagot. Tekintettel arra, hogy a fermentlében így képződő P-4 antibiotikum egy lipofil semleges anyag, könynyen elkülöníthető a fermentléből olyan elkülönítési és tisztítási módszerekkel, amilyeneket ilyen típusú 60 mikrobiális metabolitok, azaz anyagcseretermékek elkülönítésére rendszerint használunk. így például a P—4 antibiotikum a szűrt fermentléből könnyen extrahálható vízzel nem elegyedő szerves oldószerekkel, így zsírsavészterekkel (például etil- vagy amil-aee- 65 títtal), alkoholokkal (például butanollal), halogénezett szénhidrogénekkel (például kloroformmal) és ketonokkal (például metil-izobutil-ketonnal). A P-4 antibiotikum extrahálását a szűrt fermentléből közel semleges pH-n, előnyösen 7-es pH-n etil-acetáttal végezzük. Az extraktumot vízzel mossuk, majd h ökkentett nyomáson bepároljuk. A maradékhoz egy apoláris oldószert, például petrolétert vagy hexánt adunk, majd az aktív vegyületet tartalmazó nyers ter5
