179561. lajstromszámú szabadalom • Eljárás neoviridogrisein-antibiotikumok előállítására
17 179561 18 Jellemző, de nem korlátozó példa a következő összetételű keverék (súlyszázalékban): Neoviridogrisein II 27% 5 Neoviridogrisein IV (viridogrisein) 23% Griseoviridin 50% E keveréket in vivo vizsgáltuk növendék csibék ele- 10 deléhez hozzáadva. Egy napos kis kakasok 15 tagú csoportjait kezeltük. A csibéket 11 napig körülbelül 55% rozsmagot tartalmazó, és vitaminokkal, ásványokkal, zsír- és fehérjeforrásokkai kiegészített takarmányon tartottuk. E magas rozsmag-tartalom szokásosan csak mérsékelt növekedést eredményez, ezért ez a diéta standard étrendként használatos növekedést serkentő anyagok és antibiotikus takarmány-adalékok tesztelésére. Penicillint (100 ppm) alkalmaztunk pozitív kontrollként. Az adatokat az alábbi táblázatban közöljük. A takarmány/súlygyarapodás arány az 1 gramm súlygyarapodásra eső elfogyasztott eleség grammjainak számát jelenti. A testsúlyarány a 11 napos vizsgálat végén mért testsúly és a kiindulási testsúly aránya. Az utolsó oszlop az egy madárra számított átlagos súlygyarapodás (grammokban). 15 Kezelés Diéta konc. (ppm) Takarmány/súlygyarapodás arány Testsúly arány Átlagos súlygyarapodás (gramm) Rozs-kontroli __ 1,334 4,696 156,47 Penicillin 100 1,197 5,012 163,20 Vizsgált keverék 100 1,256 4,789 161.66 Vizsgált keverék 50 1,283 4,892 163.47 Vizsgált keverék 25 1,204 5,226 174,67 25 A következő példák a találmány további ismertetésére szolgálnak, anélkül, hogy annak oltalmi körét korlátoznák. 1. példa 0,5% szójabablisztből, 0,5% Pharmamedia-ból (Traders Oil Mill Co.), 0,5% zablisztből, 0,5% száraz élesztőből és 0,5% répa-melaszból álló előtenyészet-táptalaj pH-ját 6,5-re állítjuk be és 50 ml-ét 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba töltjük. 120°C-on 15 percig autoklávozzuk, majd ferde ISP—2 agaron növő Streptomyces sp. P 8648 oltókacsnyi mennyiségével beoltjuk és a lombikot 28 °C-on 48 óráig inkubáljuk forgó rázógépben. A fenti előtenyészet 2 ml-ét 100 ml következő összetételű táptalajt tartalmazó 500 ml-es Erlenmeyer-lombikba visszük át: Szójababliszt 0,5% Földimogyoróliszt 0,5% (autoklávozás előtt (pH 6,5-re beállítva) Zabliszt 0,5% Száraz élesztő 0,5% Répa-melasz 0,5% seoviridinből álló 90 mg nyers port kapunk. E nyers port elkeverjük kevés szilikagéllel és szilikagél-oszlopra (Wako-Gel C—100, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 1,5 x 25 cm) visszük fel. A szilikagél- 30 -oszlopot először 300 ml benzol/aceton 5 : 1 eleggyel, majd benzol/aceton 2 : 1 eleggyel eluáljuk. Automatikus frakciószedő készülékkel 10g-os frakciókat gyűjtünk. A 25—35. számú aktív frakciókat egyesítjük és szárazra párolva 30 mg neoviridogrisein-keve- 35 réket kapunk (neoviridogrisein I, II és III és viridogrisein). Ezenfelül a 45—54. számú aktív frakciókat szárazra párolva nyers port kapunk, melynek antibiotikus aktivitása griseoviridinnek felel meg (rétegkromatográfia alapján). E két készítményt rétegkroma- 40 tográfiával (TLC) vizsgáljuk a már megadott körülmények között. A mikroba-elleni aktivitást nutrient agar-lemezen növő Sarcina luteán határozzuk meg. TLC-lemez: Silica Gel Fertigplatten, 60F-254 E. Merck, Darmstadt 1. oldószer: kloroform/metanol = 20 : 1 neoviridogriseinek Rf-értéke = 0.45 griseoviridin 0,05 2. oldószer: benzol/aceton =1:1 neoviridogriseinek Rf-értéke = 0.55 griseoviridin 0.13 és 28 °C-on, 96 óráig, forgó rázógépben 200-as percenkénti fordulatszámmal (körsugár 3,5 cm) tenyésztjük. 12 lombik tenyészlevét összegyűjtjük és átszűrve áttetsző tenyészlészűrletet kapunk. A szűrőlepényt 100 ml vizzel átmossuk. A mosóvizeket és a tenyészlé-szűrletet egyesítjük. Ezen oldat (pH 8,3) antibiotikus aktivitását Sarcina lutea nutrient agar lemezén meghatározva 23,0 mm-es gátlási zónát találunk, ha a standard papírkorongos módszert alkalmazzuk 8 mm-es papírkorongokat használva. A fenti vizes oldat 800 ml-ét 2 x 200 ml n-butanollal extraháljuk, a butanolos kivonatokat egyesítjük és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. Neoviridogriseinekből és gri- 65 55 2. példa Az 1. példában leírt táptalajon növő Streptomyces sp. 48 órás tenyészetének 200 ml-ével beoltjuk az 1. példában leírt 10 liter előtenyészet-táptalajt tartal- 60 mazó 15 literes rozsdamentes acél-fermentort és a tenyésztést 27—28 °C-on 96 óráig folytatjuk, steril levegővel történő mesterséges levegőztetés (5 liter per perc) közben. A tenyésztés alatti keverést percenkénti 200 fordulattal, terelőlapát segítségével végezzük, melynek sugara a fermentor átmérőjének mintegy 1/4 9
