179542. lajstromszámú szabadalom • Specifikus kötésen alapuló kimutatási módszer és kompozíció antigének és haptének kimutatására
11 179542 12 A. táblázat Fényt kibocsátó reakciórendszer A. ATP + redukált luciferin AMP 4- oxidált luciferin + hv (szentjánosbogár) Konjugátban kötött reaktáns ATP vagy redukált luciferin B. FMNH2 + hosszú szénláncú aldehid + 0-,luciferáz (P. fisheri) h v + FMN + hosszú szénláncú sav + víz _ NADH-dehidrogenáz C. 1. NADH + FMN + H®------------------------* NAD + FMNH2 luciferáz 2. FMNH2 + hosszú szénláncú aldehid + 02------------> hv + FMN 4- hosszú szénláncú sav + víz (P- Fisheri) 1. 3’,5’-adenozin-difoszfát + redukált luciferin-szulfát szulfát-.transzferáz D. G. H. I. J. adenozin-3’-foszfát-5’-foszfoszulfát + redukált luciferin 2. redukált luciferin + 02-------------hv + oxidált luciferin E. redukált lunúnol 4-H202 ----► (vagy kataláz) lm 4- oxidált luminol 4- H2 0 . , „ „ , peroxidáz F. redukált pirogallol + H2 02 ----------------> hv + oxidált (vagy kataláz) pirogallol + H2 0 , , ,u, . . oxigenaz redukált luminol 4- 02-------------* \\p + oxidált luminol redukált pirogallol + 02 §eüí^hi' + oxidált piiogallol izoluminol 4- H202 laktowroxldáz) hv 4- aminoftalát + N2 izoluminol + K02---------------------------------> hv + aminoftalát 4- N2 FMNH2 vagy hosszú szénláncú aldehid NADH vagy FMN 3’,5’-adenozin-difoszfát vagy redukált luciferin redukált luminol redukált pirogallol redukált luminol redukált pirogallol izoluminol izoluminol A találmány szerinti eljárásban hasznosítható fényt kibocsátó reakciórendszerekről további információk 45 találhatók a J. Biol. Chem., 236,48 (1961), J. Amer. Chem. Soc., 89, 3944 (1967), Am. J. Physiol., 41, 454 (1916), Bioi. Bull., 51, 89 (1926) és J. Bioi. Chem., 243, 4714 (1968) irodalmi helyeken, továbbá Cornier és munkatársai „Bioluminescence in Prog- 50 ress” című könyvének 363-384. oldalán (a könyv Johnson és munkatársai szerkesztésében a Princeton University Press, New-Jersey, amerikai egyesült államokbeli kiadó gondozásában 1966-ban jelent meg) és Kries, P. „Purification and Properties of Renilla Luci- 5í ferase” című doktori értekezésében, amelyet az University of Georgia amerikai egyesült államokbeli egyetem adott ki 1967-ben. Az előnyös és érzékeny követési reakció egy másik típusa esetében enzim-katalizált fluoreszcencia jelent- 6C kezik. Egy ilyen reakciórendszerben a konjugátban kötött reaktáns egy olyan enzimatikus reakcióban szubsztrát, amely olyan terméket képez, amely a konjugátban kötött szubsztrát fluoreszcens tulajdonságaitól eltérő fluoreszcens tulajdonságokat mutat. Ha a 65 specifikus kötési reakcióból eredően a konjugátbar kötött enzimatikus reaktáns aktivitásában bárminemi változás következik be, akkor a reakcióelegy fluoreszcens tulajdonságaiban is változás megy végbe. Egy ilyen enzim-katalizált re akció rendszert az alábbi általános reakcióvázlattal lehet jellemezni: enzimatikus reaktáns—X—Z (enz*m) termék (szubsztrát) ahol X egy enzim által hasítható kötést vagy összekötő csoportot, például egy észter- vagy egy amidocsoportot jelent, Z pedig egy specifikus kötésre alkalmas anyag, amely — a specifikus kötési technikától függően - a ügandum, a lígandum specifikus kötési analógja vagy a ligandum specifikus kötőpartnere lehet. Az ilyen típusú reakciórendszerekben használható specifikus konjugátokhoz tartoznak például a fluoreszcein, umbelliferon, 3-indol, (3-naftol, rezorufin és a 3-piridol különböző, enzimek által hasítható származékai. Ilyen származékokként például az alábbi vegyületeket használhatjuk: (lásd ábrák) 6
