179464. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A-40 104 jelű antibiotikum előállítására
15 179464 16 Az így előállított 1 ml térfogatú tárolt szuszpenzióval 50 ml, az előzőekben megadott összetételű vegetatív táptalajt oltunk. A beoltott első vegetatív tenyészetet 250 ml térfogatú szélesszájú Erlenmeyer-lombikokban inkubáljuk 25 °C hőmérsékleten 4 napon át olyan rázóasztalon, amely körülbelül 5 cm átmérő mentén percenként 250-et fordul. B. Tankfermentáció Nagytérfogatú inokulum előállítására 10 ml fentiek szerint előállított vegetatív tenyészettel 400 ml második vegetatív táptalajt oltunk, amelynek összetétele az első vegetatív táptalaj összetételével azonos. Ezt a második vegetatív tenyészetet 2 liter térfogatú szélesszájú Erlenmeyer-lombikokban 25 °C hőmérsékleten 48 órán át inkubáljuk olyan rázóasztalon, amely körülbelül 5 cm-es kitéréssel percenként 250-et fordul. A fentiek szerint előállított kinőtt második vegetatív tenyészet 800 ml-ével 100 liter alábbi összetételű steril táptalajt oltunk: glükóz 1,5% glicerin 0,5% tápióka dextrin 3% szárított kutyaeledel3 2,5% élesztőkivonat 0,5% káliumklorid 0,1% magnéziumszulfát x 7H2 O 0,05% vas(II)-szulfát x 7H20 0,01% mangán-klorid x 4H20 0,005% cink-szulfát x 7H2 O 0,005% kalcium-karbonát 0,01% ionmentes víz. A táptalaj pH-ját 4N hidrogénkloriddal 5,0-re állítjuk be. “Purina Dog Cow, Raispon Purina Co., St. Louis, Mo., 63 188. A beoltott termelő táptalajt 165 literes fermentorban 30 °C hőmérsékleten 12 napon át fermentáljuk. A tenyészeten annyi steril levegőt vezetünk át, hogy az oldott oxigén koncentrációja a maximum 80%-át étje el. 2 2. példa Az 1. példa szerinti fermentációt végezzük el, vegetatív táptalajként azonban az alábbi összetételű táptalajt használjuk: dextróz 0,5% galaktóz 0,5% glicerin 0,5% oltható keményítő 0,5% élesztőkivonat 0,2% szárított kutyaeledel3 0,5% szójababolaj 0,2% kukoricaolaj 0,2% kálium-dihidrogén-foszfát 0,3% magnézium-szulfát x 7H20 0,05% vas(II)-szulfát x 7H20 0,01% CaC03 kalcium-karbonát 0,1% mangán-klorid x 4H2 0 0,005% cink-szulfát x 7H20 0,005% ionmentes víz “Purina Dog Cow. A táptalaj pH-ja 5,7, amit 4N hidrogénkloriddal 5,0-re állítunk be. 3. példa Az 1. példában megadottak szerint fermentálunk, főfermentációs táptalajként azonban az alábbi összetételű táptalajt használjuk: glükóz 5,0% szójababdara 0,75% magnézium-szulfát x 7H2 O 0,1% kalcium-karbonát 0,2% ionmentes víz. A táptalaj pH-ja 7,4, amit 4N hidrogénkloriddal 6,5-re állítunk be. 4. példa Az A-40 104 A és C komponensek elkülönítése 5450 liter, a 3. példában megadottak szerint előállított teljes fermentlevet szűrési segédanyag jelenlétében (Hyflo Super-cel, diatomaföld, Johns-Manville Probicts Corp., USA) szűrünk, szűrletként 3640 liter oldatot kapunk. Ionmentes vízzel mossuk a szűrési maradékként kapott micéliumot, amikor további 1820 liter szűrletet kapunk. Az 5460 liter térfogatú egyesített szűrletet a szűrlet pH-ján 0,5 térfogat toluollal egy órán át extraháljuk, ami után 2500 liter toluolos extraktumot kapunk. Ez a toluolos extraktum elsősorban az A-40 104 C komponenst (pleuromutilin) tartalmazza. Körülbelül 23 literre töményítjük a toluolos extraktumot. Ekkor 1943 g A-40 104 C komponens kristályosodik ki, amit szűréssel elkülönítünk. 8 liter térfogatra töményítjük az anyalúgot. Ebből további 282 g C komponens különül el. Ismét sűrítjük az anyalúgot, a 6 liternyi sűrítményből 4 °C-ra való hűtést és 72 órán át történő tárolást követően további 158 g C komponens különül el. Az ezután megmaradó anyalúgot viszkózus olajos desztillációs maradékig sűrítjük, amit 6 liter dietiléterben oldunk. Az oldatot 72 órán át 4 °C hőmérsékleten tartjuk, ami után további 112 g A—40 104 C komponenshez jutunk. A toluolos extrakció után visszamaradt vizes oldatot 0,5 térfogat kloroformmal extraháljuk egy órán át. Az elkülönített kloroformos oldatot körülbelül 10 literre sűrítjük, és 72 órán át 4 °C hőmérsékleten tartjuk. Az oldatból kivált kristályokat szűréssel elkülönítjük és szárítjuk, ami után 588 g A-40 104 A komponenst kapunk. 5. példa Az A—40 104 antibiotikum-komplex és a B komponens elkülönítése 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
