179435. lajstromszámú szabadalom • Diagnosztikai eszköz leukociták kimutatására testfolyadékokban és eljárás az ehhez megfelelő színképzők előállítására
3 ! 79435 4 Néhány éve hódítottak tartósan teret a hiszto- és dtokémiai enzimológiában olyan kolorimetriás kimutatási módszerek, amelyek a meghatározandó rendszerekben előforduló enzimek észteráz aktivitásán alapulnak. (Lásd például A. G. E. Pearsc, Histochemistry, Theoretical and Applied.). Lényegében színtelen vagy enyhén színes észtereket reagáltaínak, amelyek az enzimes hasításkor legtöbbnyire színtelen savkomponensre és szintén színtelen alkohol-(fenol)- komponensre esnek szét. Az utóbbiakat azután az enzimes hidrolízist követő reakcióban színes termékekké reagáltatják (például diazóniumsókkal kapcsolva vagy oxidativ reakciókkal). Így például F. Schmalzl és H. Braunsteiner a Kiin Wschr. 46, 642 (1968)-ban leírtak egy specifikus citokémiai leukocita-észteráz kimutatást, ahol szubsztrátként Naphtoi-As-D-klór-acetátot és a színes azo-vegyület képzéséhez valamilyen diazóniumsóí használtak. Leukociták testfolyadékokban, így például vizeletben való gyors és egyszerű kimutatására szolgáló diagnosztikai eszközként az ilyen fajta kétkomponensű rendszerek nem bizonyultak megfelelőnek, mivel a vizeletben előforduló sok egyéb vegyület, így urobilinogén, szterkobilinogén, bilirubin és egyebek, diazóniumsókkal szintén reagálnak. Ezért ez a módszer túlságosan érzéketlen. Például 5000 leukocita/pl esetén semmilyen reakciót nem mutatnak a minták. Meglepően azt találtuk, hogy stabil és gyorsan jelző diagnosztikai szert kapunk, amellyel testfolyadékokban jól kimutathatók leukociták, ha a neutrofil leukocita-granulocitákban előforduló észterázok kimutatásához szubsztrátként szulfonftalein-észtereket alkalmazunk. A jelen találmány tárgya ezért diagnosztikai szer, leukociták kimutatására testfolyadékokban, amely egy színképzővel és szokásos adalékanyagokkal impregnált szívóképes hordozóból áll, és az jellemzi, hogy a leukocitákban előforduló észterázok kimutatására szubsztrátként I általános képletű szulfonftalein-észtereket — a képletben Rí jelentése valamely, adott esetben halogénatommal vagy rövidszénláncú alkoxicsoporttal szubsztituált 1-5 szénatomos alifás karbonsav- benzoesav- vagy naftoesavgyök, benzoil-oxi-karbonil- vagy rövidszénláncú alkoxi-karbonil-nitrogén-védőcsoporttal rendelkező aminosav- vagy 2 4 aminosavból álló peptid-gyök, emellett az aminosav- vagy peptidgyök adott esetben nitro- vagy O-acetil-csoporttal szubsztituált, R2 jelentése halogénatom vagy valamely rövidszénláncú alkilcsoport, R3 és R4 jelentése azonos vagy eltérő, éspedig hidrogénatom vagy halogénatom — tartalmaz. A találmány tárgya továbbá eljárás leukociták testfolyadékokban való kimutatására szolgáló diagnosztikai eszközök előállítására. Az I általános képletű szulfonftalein-észterek nagyrészt új vegyületek. Az irodalomból eddig csak 2 a 4’,4”-diacetiI-3’,5’,3”,5”- tetrabróm-fenolszulfonftalein (=brómfenolként-diacetát) és a 4’,4”-díbenzoil-3’,5’,3”,5”-tetrabróm-fenolszulfonftalein (--brómfenolkék-dibenzoáí) ismeretes. [W. R. Omdorff, F. W. Sherwood, J. Am. Chem. Soc. 45, 486 (1923)]. A találmány további tárgya eljárás I’ általános képletű új szülfonftáléin észterek előállítására — a képletben R2, R3 és R4 jelentése az előbb megadottakkal azonos és R’, jelentése azonos Rí jelentésével, azzal a megkötéssel, hogy ha R2 és R3 jelentése brómatom és R4 jelentése hidrogénatom, akkor Rí acetil- vagy benzoil-csoporttól eltérő jelentésű. Az I’ általános képletű új szulfonftalein-észterek előállítása önmagában ismert módszerekkel történik. Előnyösen önmagában ismert módon a megfelelő ismert II általános képletű szulfonftaleineket - ahol R2, R3 és R4 jelentése az előbb megadottakkal azonos - III általános képletű savakkal - ahol Rj jelentése az előbb megadottakkal azonos — illetve ezek alkalmas reakcióképes származékaival reagáltatjuk. A karbonsav-észterek előállításánál reakcióképes származékokként főleg a megfelelő karbonsavanhidrideket illetve karbonsav-kloridokat használjuk, adott esetben tercier aminok hozzáadása közben. Az aminosav- és peptid-észterek előállításánál a peptidkémiában szokásos szintézismódszereket, így például a vegyes anhidrides és a savkloridos módszert alkalmazzuk. Az Rj, Rj, R2, R3 és R4 jelentésénél említett halogénatomokon fluor-, klór- és brómatomokat, előnyösen klór- és brómatomot értünk. Az Rí illetve Rj szubsztituensek jelentésénél említett „rövidszénláncú alkoxicsoport” valamint az R2 szubsztituens jelentésénél említett „rövidszénláncú alkilcsoport” 1—5, előnyösen 1—3 szénatomot tartalmaz. Legelőnyösebb a metoxi- illetve metil-csoport. Az Rt illetve Rj szubsztituensek jelentésénél említett alifás karbonsavgyökök előnyösen 1—4 szénatomos alifás karbonsavak savgyökei, különösen előnyös az acetil-, propionil-, valamint a benzoil-gyök. Az R] illetve Rj szubsztituensek jelentésénél említett aminosavgyökök a természetes L-a-aminosavak gyökei. Különösen előnyös az L-alanin, L-fenilalanin, L-lizin, L-tirozin és L-arginin savgyöke, amely egy nitro csoport tál lehet szubsztituálva, és az esetleg jelenlevő hidroxilcsoport adott esetben valamilyen szokásos oxigén-védőcsoporttal, például acetilcsoporttal lehet védve. Az Rí illetve Rj szubsztituensek jelentésénél említett peptidgyökön di-, tri- és tetrapeptidek, előnyösen dipeptidek gyökeit értjük, amelyeknek aminosav-komponensei előnyösen az előbb említett aminosavakból kerülnek ki. A színképzőkként használt I általános képletű szulfonftalein-észtereket ÍCT4 — 10_1 mól/liter, elő-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 z.
