179431. lajstromszámú szabadalom • Tárolható koleszterinoxidáz készítmény
3 179431 4 közé a koleszterinoxidáz is tartozik, alkáli-kloridók nagyobb koncentrációban inaktiválják [Theoreil, Acta Chem. Scand. 3. 1649 (1954)]. Az előbb megadott körülmények között jó stabilitás 4,5 és 8,5 pH-értékek között áll fenn. A talál- 5 mány szerinti koleszterinoxidáz készítmény pH-ja előnyösen 5,0 és 6,5 között van. A puffer molaritása általában 0,01 mól és 0,2 mól közötti, előnyös a 0,01 móltól 0,1 mólig terjedő tartomány. Pufferanyagkcnt minden olyan só használható, io amely a fent megadott tartományban pufféról, például kálium-foszfát puffer, nátrium-foszfát puffer, káüum-foszfát/citromsav puffer, nátrium-acetát puffer stb. Egyes esetekben már eddig is tároltak enzimeket 15 alkáli-klorid oldatokban. Ilyenkor azonban eljárási okok voltak mérvadók, például papain jobb kristályosíthatósága nátrium-klorid oldatban, mint ammónium-klorid oldatban, vagy a lektinek tisztítása kromatográfiávai nátrium-klorid oldatban, hogy ennek a 20 rosszabb stabilitás velejárója lehetett. Flavinenzimek esetében azonban ilyen tárolási forma eddig nem volt ismeretes, mivel ez savas pH-értéken a prosztetikus csoport lehasadásához vezet. A találmány szerinti koleszterinoxidáz készítménynek az ammónium-szulfáttal stabilizált koleszterinoxidáz készítményhez viszonyított kiemelkedő tárolási stabilitása kiderül a következő kísérletekből : Egy adag 450 egység/ml enzimkoncentrációjú koleszterinoxidázt 0,05 mólos 6 pH-jú kálium-foszfát pufferban az alábbi táblázatban felsorolt sókoncentrácíókra állítunk be, és 4 héten át 4 °C-on illetve + 35 °C-on tartjuk. Az ezen idő eltelte után megállapított maradék-aktivitást mutatja az alábbi I. táblázat. (A 2 hét után mért értekek zárójelben). A találmány szerinti előnyös stabilizálás független az enzimkoncentrációtól és az enzimgyártmánytól (az egyes gyártási adagok gyakran eltérő stabilitásúak), és ez még erősebben kifejezésre jut, ha nem 1 mólos, hanem 3 mólos ammónium-szulfát oldattal végezzük az összehasonlítást. I. táblázat Tárolási hőmérséklet 1 mólos AS Az adalék fajtája és koncentrációja 3 mólos NaCl 3 mólos KC1 + 4 °C ( 100%)100% (96%) 96% (100%) 100% zavaros tiszta tiszta + 33 °C (86%) 55% (88%) 88% (91%) 87% zavaros tiszta tiszta AS = ammónium-szulfát II. táblázat Adag Enzimkoncentráció 1 mólos A$. 3 mólos AS 3 mólos NaCl 1 300 egység/ml 30 egység/ml (73%) 58% (77%) 67% (68%) 49% (100%) 92% (100%) 96% 2 300 egység/ml 30 egység/ml (73%) 68% (55%) 55% (87%) 33% (100%) 88% (100%) 88% Két különböző enzimadagot a fent megadott pufferral 300 egység/ml illetve 30 egység/ml koncentrációra állítottunk be, és azután a fent leírtak szerint 4 hétig 35 °C-on tartottuk. Az alábbi 11. táblázat adja meg a 4 hét múlva mért maradék-aktivitásokat. Zárójelben a 2 hét után mért értékeket tüntetjük fel. 55 Adalék Chol-ODIII. táblázat Maradék-aktivitás + 35 °C-on Annak bemutatására, hogy a találmány szerinti 60-oldathoz 2 hét után 4 hét után kiemelkedő stabilizálás egy bizonyos koncentrációtartományra korlátozódik, egy meghatározott konadalék nélkül 80% 47% centrációjú enzimadagnál tárolási kísérleteket végeztünk 35 C-on 2 hétig, illetve 4 hétig. Az eredménye10 mmól NaCl 80% 47% 0,1 mól NaCl 85% 50% ket a III. táblázat szemlélteti. 65 3 mól NaCl 93% 54% 2
