179431. lajstromszámú szabadalom • Tárolható koleszterinoxidáz készítmény
MAGYAR népköztársaság SZABADALMI LEÍRÁS 179431 Bejelentés napja: 1978. XII. 13. (BO-1754) Német Szövetségi Köztársaság-beli elsőbbsége: 1977. XII. 14. (P 27 55 799.9) Nemzetközi osztályozás: NSZ03: C 12 N 9/04, C12N11/14 ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL Közzététel napja: 1982. II. 27. Megjelent: 1984.1. 31. Szabadalmi Tár. ^ »^-AJDONN jy Feltalálók: Szabadalmas: Thum Waldemar vegyésztechnikus, Tutzing-Unterzeismering, Lang Gunter ve- Boehringer Mannheim GmbH, gyésztechnikus, Dr. Vetter Helmut biokémikus, Dr. Naeher Gotthilf gyógyszerész, Mannheim-Waldhof, Tutzing, Német Szövetségi Köztársaság Német Szövetségi Köztársaság Tárolható koleszterinoxídáz készítmény 1 A találmány tárgya tárolható, vizes koleszterinoxidáz készítmény, amely puffert és stabilizálószert tartalmaz. Egy protein enzimaktivitását az aminosavgyököknek az enzim polipeptidláncában való térbeli elrende- 5 ződése határozza meg. Ezt a „konformációt” vizes oldatban elektromosan töltött vagy töltetlen szervetlen valamint szerves molekulák jelenléte befolyásolja. Ennek következtében az enzimek vizes oldatban rendszerint nagyon érzékenyek, és könnyen aktivitás- 10 csökkenést szenvednek. A vizes enzimkészítményeket ezért stabilizálni kell. Kismolekulájú szervetlen sók hatására vonatkozólag ismeretes, hogy ezek anionos, valamint kationos komponensei vagy többnyire stabilizálólag vagy is többnyire denaturálólag hathatnak az enzim konformációjára. Az ilyen anionokat és kationokat ezen hatásra való tekintettel az úgynevezett Hoffmeister-sorba sorolták [Timasheff and Fasman, „Structure and Stability of Biological Macromolecules”, Mércéi 20 Dekker, Inc. kiadás, New York, 1969, 427. old.]. A Hoffmeister-sor szerint az anionok és kationok egymástól függetlenül vagy többnyire stabilizálólag vagy többnyire denaturálólag hatnak. A stabilizáló hatás élén a szulfát-anion és kvaterner ammóniumionok 25 állnak, ezeket követi az ammóniumion. Könnyen érthető ezért, hogy a kereskedelmi enzimkészítmények túlnyomó többsége stabilizálószerként ammónium-szulfátot tartalmaz, önmagában vagy adott esetben egyéb specifikus stabilizálószerekkel együtt. A 30 kcleszterinoxidázt is kereskedelmi forgalomban levő vizes oldatban eddig ammónium-szulfáttal stabilizálták. Kimutatták azonban, hogy a koleszterinoxídáz stabilitása ammónium-szulfát oldatban kifogásolható. A legjobb stabilizáló hatást körülbelül 1 mólos ammónium-szulfát koncentráció eredményezi, és nagyobb ammónium-szulfát koncentrációnál csökken a stabilitás. Már 1 mólos koncentrációnál is előfordulnak időnként durva, rögös, zsíros enzimkiválások, amelyek azonban enzimatikusan még aktívak, de az adagolást a kiszereléskor (letöltésnél) nehezítik. Meglepően azt észleltük, hogy ez a nehézség elkerülhető, és egyrészt a kiválás teljesen megakadályozható, másrészt kiváló stabilizálás érhető el, ha stabilizálószerként nátrium-kloridot vagy kálium-kloridot használunk 2,0 és 3,5 mól közötti koncentrációban. A találmány tárgya ezért olyan puffert és stabilizálószert tartalmazó, tárolható, vizes koleszterinoxidáz készítmény, amelyre az jellemző, hogy literenként 2-3,5 mól nátrium-kloridot vagy kálium-kloridct tartalmaz stabilizálószerként. Előnyösen 2,5 és 3,2 mól közötti koncentrációban nátrium-kloridot tartalmaz. Az említett sók kiemelkedő stabilizáló hatása nem volt várható, mivel a Hoffmeister-sor szerint a kálium és nátrium lényegesen kevésbé stabilizál, azaz erősebben inaktivál, mint az ammonium, és a klorid is sokkal erősebben inaktivál, mint a szulfát. Ehhez jön még az, hogy különösen a flavinenzimeket, amelyek 179431
