179396. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-oxo-L-gulonsav előállítására
3 179396 4 hasonló módon állíthatunk elő - is megvalósítható. A találmány szerinti eljárás szempontjából a mikroorganizmusok 2-oxo-L-gulonsav-termelő képességét könnyen mégha tár ózhatjuk oly módon, hogy a mikroorganizmust 2,5-dioxo-D-glükonsav vagy egy sója jelenlétében vizes táptalajban tenyésztjük, a leírás és a példák szerint. A Citrobacter törzset 2,5-dioxo-D-glükonsav vagy sója jelenlétében olyan vizes táptalajban tenyésztjük, amely szénforrást — például glükózt, szorbitot, fruktózt, szacharózt, glicerint vagy hasonlókat — tartalmaz. Előnyös szénforrás a glükóz, előnyösen glükóz-monohidrát (cerelose) alakjában. A hagyományos fermentációs gyakorlattal összhangban természetesen a táptalaj nitrogén-, kálium-, foszfor- és magnézium-forrást is tartalmaz. A „vizes táptalaj” kifejezést a leírásban és az igénypontokban olyan értelemben használjuk, hogy az a fent felsorolt tápanyagokat tartalmazó táptalajt jelenti, kívánt esetben további tápelem-forrásokkal kiegészítve. A szénforrás általában 0,5-15 gAiter, előnyösen kb. 1-5 gAiter koncentrációban van jelen a táptalajban. A nitrogén gazdaságosan oly módon biztosítható, hogy karbamidot vagy szervetlen nitrogénforrásokat — például ammóniumszulfátot, ammóniumnitrátot, ammóniumfoszfátot — vagy hasonló sókat alkalmazunk, például 0,1-2 gAiter táptalaj koncentrációban. A kálium, magnézium és foszfor sók — például káliumfoszfát, ammóniumfoszfát, magnéziumszulfát vagy hasonló sók — adagolásával vihető be, általában 0,1—2 gAiter fermentlé mennyiségben. Az említett tápanyagok koncentrációja nem kritikus és jelentős változtatások lehetségesek a táptalaj összetételében. Más megfelelő összetételű táptalajok megválasztása a szakember számára kézenfekvő és ezért a találmány szerinti eljárást nem korlátozzuk az előbbiekben és a példákban leírt konkrét táptalajok alkalmazására. A hagyományos fermentációs gyakorlattal összhangban a Citrobacter törzset általában egy olyan vizes inokulum táptalajba visszük be, amely a fent leírt tápanyagokat, és kívánt esetben további tápanyagokat, például élesztőkivonatot vagy peptont tartalmaz. A mikroorganizmust ezután 1—3 napon át, előnyösen 25—35 °C hőmérsékleten, különösen 25 — 30 °C-on és 5—7,5 pH-tartományban tenyésztjük. A Citrobacter törzset tartalmazó, kapott inokulum tenyészetet megfelelő mennyiségben, például 1-10% (térf./térf.) arányban bevisszük a vizes táptalajba, amelyet a 2,5-dioxo-D-glükonsav redukciójára alkalmazunk. A 2,5-dioxo-D-glükonsav jelen lehet a vizes táptalajban, a beoltáskor, vagy előnyösen később, például 8—36 órás tenyésztés után adagolható be. A 2,5-dioxo-D-glükonsav sav alakjában, vagy a szabad sav sójaként, például alkálifém vagy alkáliföldfém sójaként vihető be. Előnyös só a nátrium- és a kalcium-2,5-dioxo-D-glükonát. A 2,5-dioxo-D-glükonsav vagy sói a szakember számára jól ismert fermentációs módszerekkel állíthatók elő (lásd például a 3790444 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírást). Eljárhatunk úgy, hogy a 2,5-dioxo-D-glükonsavat tartalmazó fermentlé meghatározott mennyiségét adjuk hozzá a Citrobacter törzset tartalmazó vizes tápoldathoz. Egy másik megoldás szerint a 2,5-dioxo-D-glükonsavat vagy sóját elkülönítjük a fermentléből és így adjuk hozzá a Citrobacter törzset tartalmazó táptalajhoz. A 2,5-dioxo-D-glükonsav kiindulási anyagot előnyösen meghatározott mennyiségű, az Acetobacter cerinus glükóz-tartalmú táptalajban végzett aerob tenyésztésével előállított fermentlével adjuk a táptalajhoz. Az említett aerób tenyésztéssel kapcsolatos eljárást írnak le a 872 095 számú belga szabadalmi leírásban és az 1979. szeptember 28-án benyújtott, 79 665 számú belga szabadalmi bejelentésben. A fermentlé 5-20 (súly/térf.)% 2,5-dioxo-D-glükonsavat vagy sóját tartalmazza, és belőle akkora mennyiséget kell hozzáadnunk a Citrobacter táptalajhoz, hogy 1,0—10 (súly/térf.)% kiindulási 2,5-dioxo-D-glükonsav vagy glükonsav-só koncentrációt biztosítsunk. Egy másik megoldás szerint elkülönített 2,5-dioxo- D-glükonsavat vagy sóját adagolhatjuk, annak érdekében, hogy ezt a 2,5-dioxo-D-glükonsav koncentrációt létrehozzuk a Citrobacter fermentlében. A Citrobacter törzs fermentációját a 2,5-dioxo-D-glükonsavat tartalmazó táptalajban 25-35 °C, előnyösen 25—30 °C hőmérsékleten végezzük. A fermentáció alatt a közeg pH-ját előnyösen 5,5-7,5 tartományban tarjuk, szükség szerint sav vagy lúg adagolásával. Megfelelő sav például a kénsav és a foszforsav, megfelelő bázis például valamely alkálifémhidroxid, előnyösen nátriumhidroxid vagy valamely alkálifém vagy alkáliföldfém karbonát, például nátriumkarbonát vagy kalciumkarbonát. Ha ilyen sókat adunk a táptalajhoz a pH beállítására, a 2-oxo-L-gulonsavat természetesen a megfelelő fémsó, például nátriumsó vagy kalciumsó vagy ezek keveréke alakjában kapjuk, és ezek a sók is a találmány körébe tartoznak. A fermentáció közben a közeget keverjük, például mechanikus keverővei vagy az edény rázatásával. Kívánt esetben további mennyiségű 2,5-dioxo-D-glükonsavat vagy sóját adagolhatunk a közeghez a fermentáció közben, miután a Citrobacter freundii felhasználta a kiindulási 2,5-dioxo-D-glükonsav egy részét. így 2-oxo-L-gulonsavat vagy sóját jobb hozammal állíthatjuk elő. A fermentációt a 2-oxo-L-gulonsawá való átalakulás befejeződéság folytatjuk. Ha például Citrobacter freundü ATCC 6750-et használunk, a 2,5-dioxo-D-glükonsav vagy sója átalakítása lényegében 36-72 óra alatt befejeződik, a kiindulási 2,5-dioxo-D-glükonsav koncentráció, a fermentációs körülmények és más tényezők függvényében, és a kiindulási 2,5-dioxo-D-glükonsav súlyára számítva 30%-os kitermeléssel kapjuk a 2-oxo-L-gulonsavat. A fermentációs reakció menetét úgy követhetjük, hogy a szakember számára jól ismert analitikai módszerek alkalmazásával — ideértve a papírkromatográfiát a vékonyrétegkromatográfiát, és a nagynyomású folyadékkromatográfiát — meghatározzuk a reakcióelegyben visszamaradó 2,5-dioxo-D-glükonsav és a keletkező 2-oxo-L■gulonsav koncentrációját. A terméknek a 2-oxo-L-gulonsawal való azonosságát ezután úgy igazolhatjuk, hogy a szokásos módszerek alkalmazásával elkülönítjük és jellemezzük azt (lásd például a J.C.S. Chem. Comm. 1979., 740. helyét). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
