179360. lajstromszámú szabadalom • Eljárás timidin-foszforiláz előállítására
5 179360 6 hoz uracilon és szervetlen foszfáton kívül olyan mikroba-ellenes szert is adunk, amely az enzim aktivitásának befolyásolása nélkül sterilizálja az oldatot. A mikroba-ellenes szer töménysége 0,001—0,4% között, előnyösen 0,002—0,2% között mozoghat. Megfigyeltük, hogy a fentiekben leírt timidin-foszforiláz-készítmény stabilitása a pH-tól is függ. Az enzim stabilitása 6—8 pH-értékű, előnyösen 7 pH-értékű közegben a legnagyobb. A találmány szerint előállított timidin-foszforiláz-készítményből olyan steril kiszerelési egységek készíthetők, amelyeknek tartalma közvetlenül felhasználható diagnosztikai laboratóriumokban. A találmány tárgyát a következő példák világítják meg anélkül, hogy a találmány tárgya ezekre korlátozódna. 1. példa Escherichia coli-ból elkülönített és ammónium-szulfáttal stabilizált timidin-foszforiláz-készítmények stabilitását vizsgáltuk különböző kezdeti enzim-koncentráció esetén. Az enzim-oldatok 700 mM ammónium-szulfátot, 83 mM kálium-foszfátot, és 2,5% marha szérum-albumint tartalmaztak, pH-értékük 6,8 volt. Az enzim-aktivitást 25 °C-on és 290nm-nél mértük (AE= 1000 M"1 cin'1), ahol a reakcióelegy 200 mM 7,4 pH-értékű kálium-foszfátot és 1 mM timidint tartalmazott. A következő eredményeket kaptuk: Timidin-foszforiláz kezdeti aktivitása (nemzetközi egység I.U./ml) Maradék aktivitás a kezdeti aktivitás százalékában, 110 napig 5 °C-on való tárolás után 1300 98 400 90 40 79 4 40 0,4 3 Az eredményekből látható, hogy ez a 2 602 996 számú, Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírás szerint előállított készítmény csak viszonylag nagy enzim-koncentráció esetén stabil. 2. példa Escherichia coli-ból előállított timidin-foszforiláz stabilitását vizsgáltuk híg oldatban (1,5 nemzetközi egység (I.U.)/ml) úgy, hogy nem adtunk hozzá semmit, vagy uracilt és foszfátot adtunk hozzá különböző mennyiségben, vagy uracilt, illetve foszfátot adtunk hozzá különböző pH-értékeknél. Mindegyik oldat 2,5% marha szérum-albumint és 0,2% nátrium-azidot is tartalmazott. Az enzim aktivitását az 1. példában leírt módon mértük. A következő eredményeket kaptuk: Maradék aktivitás a kezdeti aktivitás* Stabilizátor százalékában, 37 °C-on 32 napig való tárolás után pH6 pH 7 pH 8 _ 0 0 0,6 500 mM foszfát 43 72 70 17,5 mM üracil 19 1 0,9 17,5 mM uracil és 500 mM foszfát 100 100 93 0.5 mM uracil és 500 mM foszfát-85-+ = 1,5 nemzetközi egység (I.U.)/ml Az eredményekből látható, hogy az uracil vagy a káliumfoszfát egymagában nem képes stabilizálni az enzimet, csak a kettő együtt képes erre. Az is látható, hogy a két stabilizáltor az 1. példában alkalmazott enzim-koncentrációnál jóval kisebb enzim-koncentrádónál hatásos. Szabadalmi igénypontok: 1. Stabil timidin-foszforiláz-készítmény, azzal jellemezve, hogy az enzimen kívül uracilt és szervetlen foszfátot, valamint adott esetben szérum-albumint és/vagy mikroba-ellenes szert tartalmaz. 2. Az 1. igénypont szerinti készítmény kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy a szervetlen foszfátot 0,1 mM koncentrációtól a telítettségig terjedő menynyiségben tartalmazza. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti készítmény kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy a szervetlen foszfátot 0,1 M-tól l,0M-ig terjedő töménységben tartalmazza. 4. Az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti készítmény kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy szervetlen foszfátként kálium-foszfátot tartalmaz. 5. Az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti készítmény kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy szervetlen foszfátként ammónium-foszfátot tartalmaz. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti készítmény kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy 0,5 mM koncentrációtól a telítettségig terjedő menynyiségben uracilt tartalmaz. 7. A 6. igénypont szerinti készítmény kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy 1 mM-tól 20 mM-ig terjedő töménységben tartalmaz uracilt. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti készítmény kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy szérum-albumint is tartalmaz. 9. A 8. igénypont szerinti készítmény kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy marha eredetű szérum-albumint tartalmaz. 10. A 8. vagy 9. igénypont szerinti készítmény kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy 0,2%-tól 5%-ig terjedő mennyiségben tartalmaz szérum-albumint. 11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti készítmény kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy mikroba-ellenes szert tartalmaz. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
