179350. lajstromszámú szabadalom • Eljárás G-6302 antibiotikum előállítására
11 179350 12 Mint azt a fenti táblázatból láthatjuk, a találmány szerint előállított G-6302 gátló hatást fejt ki mind a Gram-negatív, mind pedig a Gram-pozitív baktériumok növekedésére. Ezért a fenti baktériumokkal fertőzött emlősök (például egér, patkány, kutya és ember) és házi szárnyasok (például baromfi, kacsa stb.) kezelésére használható. Ha a G-6302-t Escherichia coli fertőzés elleni gyógyszerként kívánjuk felhasználni, fiziológiás sóoldatban célszerű azt feloldani és parenterálisan adagolni például szubkután vagy intravénás 5-30 mg/kg napi adagban. Orális használat esetén a G—6302 antibiotikumot például laktózzal keverve kapszulákba töltjük és 20-200 mg/kg napi adagban adagoljuk. A G-6302 csíraölőként vagy fertőtlenítőszerként is használható. E célból a G—6302-t feloldjuk desztillált vízben és 0,1—1,0 súly/térfogat%-os oldatot készítünk belőle, vagy valamely kenőcs alapanyagba, például vazelinba vagy lanolinba keverjük és grammonként 5—20 mg G-6302-t tartalmazó kenőcsöt készítünk. Ezt a készítményt állatok vagy emberek lábára, szemére, fülére, vagy más testrészére használhatjuk fertőtlenítőszerként. A G—6302 olyan szempontból is jelentős, hogy új gyógyászati készítmények előállításánál intermedierként használható. A G-6302 antibiotikumot összehasonlítva az ismert antibiotikumokkal a következőket állapíthatjuk meg. Először is a vízben oldható, savas és kéntartalmú antibiotikumok közül megemlíthetjük a penicillint és a cefalosporinokat. A G—6302 viszont abban különbözik a cefalosporinoktól, hogy a spektrum ultraibolya tartományában nem abszorbeál. Továbbá, az a tény, hogy a magrezonancia spektrum alapján kémiai eltolódás vagy a O-metil protonok felé, másrészt pedig, hogy a savas hidrolízis során glutaminsav keletkezik nyilvánvalóvá teszik, hogy a G—6302 különbözik bármely másik természetben előforduló penicillintől és cefalosporintól. Másrészt, sok olyan antibiotikumot ismerünk, melyeket a Pseudomonas baktérium faj termel, de azok közül egyik sem oldható vízben, amelyik savas kémhatású és kéntartalmú. Másrészt a G-6302 nem hasonlít egyik ismert antibiotikumhoz sem, melyeket a Pseudomonastól eltérő törzsek termelnek, sajátos fiziko-kémiai és biológiai tulajdonságai miatt. A további példák a találmány részletesebb illusztrálását célozzák. A példákban % súly/térfogat%-ot jelent, hacsak másként nem definiáljuk. 1 1. példa Ferde agar tenyészetben nőtt Pseudomonas acidophila G—6302/FERM—P No. 4344, IFO 13774, ATCC—31363) sejteket használunk arra, hogy beoltsuk egy 2 x 103 ml-es Sakaguchi lombikban levő 500 ml-nyi táptalajt, amely 1% glükózt, 0,5% polipeptont (Daigo Nutritiv Chemicals Co. Japán készítmény), 0,5% húskivonatot, 0,5% nátrium-kloridot (pH 7,0) tartalmaz. A lombikot rázós gépen elhelyezve 48 óráig 28 °C-on inkubáljuk. A kapott kultúrát használjuk csíra kultúra gyanánt. Egy 200 x 103 ml-es rozsdamentes acélból készült fermentort megtöltünk 120 xlO3 ml táptalajjal, melynek összetétele 3% glicerin, 0,1% glükóz, 0,5% polipé pton, 0,5% húskivonat és 0,5% nátrium-klór id, és miután az elegy pH-ját 30%-os vizes nátrium-hidroxiddal 7,0-ra beállítottuk, 120°C-os gőzzel 20 percig sterilizáljuk. A sterilizált tankot ezután beoltjuk a fenti csíra kultúrával és 28 °C hőmérsékleten inkubáljuk, miközben 120 xlO3 ml/perc arányban levegőztetjük és 180 fordulat/perces keverést alkalmazunk 78 órán keresztül. A kapott táplevest Sharpies centrifugálszeparátorral centrifugálva eltávolítjuk a sejteket és a visszamaradt 110 xlO3 ml felül elhelyezkedő folyadék pH-ját 4,2-re állítjuk be és egy 15 x 103 ml-es, aktív csontszenet tartalmazó oszlopon engedjük keresztül (az aktív szén: chromatographic Grade Shirasagi, gyártja a Takeda Chemical Industries Ltd. Japán). Az aktív anyagok ezen adszorbeálódnak. Az oszlopot 45 x 103 ml vízzel öblítjük, majd 45 x 103 ml, 50 térfogat%os acetonnal eluáljuk. Az eluátumot 10 x 103 ml-es frakciókba gyűjtjük. A frakciókat Proteus mirabilis IFO 3849 ellen vizsgáljuk meg. A 2. és 3. számú frakciókat összeöntjük, 20 x 103 ml vizet adunk hozzá és az elegyet lOxlO3 ml Dowex-l-et (Cl formában) (Dow and Chemical Industries, U.S.A.) tartalmazó oszlopon engedjük át. Az oszlopot 25 x 103 ml vízzel öblítjük és 50xl03 ml 5%-os vizes nátrium-klorid oldattal eluáljuk. Az aktív frakciókat összegyűjtjük, a pH-ját 4,0-ra állítjuk be és ismét átengedjük egy aktív csontszénnel töltött oszlopon (8x10 ml). Az oszlopot 24 x 103 ml vízzel mossuk és 20 térfogat%-os metanollal eluáljuk. Az aktív frakciókat összegyűjtjük és 50 ml-re töményítjük be csökkentett nyomáson. Ezután 200 ml acetcnt adunk hozzá és a kapott csapadékot szűréssel elkülönítjük. 50 ml acetonnal és 100 ml dietil-éterrel mossuk, majd ezt követően csökkentett nyomáson szárítjuk. A fenti eljárás során 12 g nyers terméket kapunk. A fentiek szerint előállított nyers termékből 10g-ot feloldunk 500 ml 0,01 M os foszfát pufferben (pH 6,6) és az oldatot egy 200 g DEAE-Sepadex A—25 (Pharmacia, Sweden) tartalmú oszlopon engedjük át, amit előzőleg a fenti puffer oldattal kezeltünk. Az oszlopot 400 ml puffer oldattal mossuk, majd eluáljuk olyan ,fentivel azonos puffer oldattal, amihez előzőleg 0,5% nátrium-kloridot adtunk. Az aktív frakciókat összegyűjtjük, a pH-ját 3,2-re állítjuk be 1 N sósavoldattal, és 60 ml aktív szenet tartalmazó oszlopon engedjük át. Az oszlopot 200 ml vízzel és 100 ml 20 térfogat%-os vizes metanollal mossuk, majd ezt követően 50 térfogat%-os vizes acetonnal eluáljuk. Az aktív frakciókat összegyűjtjük, csökkentett nyomáson be töményítjük és 5 ml metanolban oldjuk. Ezután 100 ml acetont adunk hozzá, és az oldatot hidegen állni hagyjuk. A kapott csapadékot szűréssel elkülönítjük, dietil-éterrel mossuk és csökkentett nyomáson szárítjuk foszforpentoxid jelenlétében 40 °C-on 6 óráig. A fenti műveletek eredményeképpen 3,8 g port kapunk. Az anyag infravörös spektrumát az 1. ábra szemlélteti. Elemanalízis: C 34,83, H 5,41, N 13,22, S 7,65 (súly/súly%) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
