179066. lajstromszámú szabadalom • Eljárás daganaellenes poliszacharid-származékok előállítására
7 179066 8 1. példa 100 ml-es palackokba szétosztott, 2% szacharózt, 2% szójamártást, 0,3% vöröshagyma extraktumot, 0,1% magnézium-szulfátot és 0,5% kálium-hidrogén-foszfátot tartalmazó táptalajt beoltunk Coriolus versicolor Iwade FERM—P No. 2743 micéliummal, és 7 napig 30 C-on rázatva tenyésztjük. Az oltótenyészetet üvegfermentorban levő 15 liter ugyanilyen táptalajba oltjuk át, és a második oltótenyészetet 2 napig kevertetjük 200 ford/perc-cel 30 °C-on, percenként 1 térfogat levegővel levegőztetve. A 2 nap tenyésztés után a második oltótenyészetet átoltjuk 250 liter táptalajba, amely 5% szacharózt, 5% szójamártást, 0,67% vöröshagyma extraktumot, 0,05% magnézium-szulfátot, 0,1% kálium-hidrogén-foszfátot és 0,1% szilíciumot tartalmaz, és fermentorban 200 ford/perc keveréssel és 0,5 térfogat/perc levegőztetéssel 30 °C-on 48 órát fermentáljuk. A táptalaj pH-ja fokozatosan csökken a kiindulási körülbelül pH 5,5-ről körülbelül pH 3,8-ra a gomba szaporodásától függően, majd ismét emelkedni kezd. A táptalaj viszkozitása a micélium növekedésétől függően növekszik. A tenyésztést akkor fejezzük be, mikor a táptalaj viszkozitása eléri a 3,0 fajlagos viszkozitás értéket, a pH 4,0 lesz, és a micélium mennyisége 1000 mg/100 ml-re nő. A micéliumot centrifugáljuk, 5 óráig forró vízzel kevertetve extraháljuk, majd az oldatlan részt centrifugálással vagy szűréssel elválasztjuk, így kapjuk a vízoldható extraktumot. Ezt csökkentett nyomáson betöményítjük, és négy térfogat etanolt adunk hozzá apránként keverés közben, majd éjszakán át 5 C-on hagyjuk állni. A kapott csapadékot etanollal és éterrel mossuk, majd csökkentett nyomáson megszárítjuk, így 127 g nyers poliszacharidot kapunk. 100 g nyers poliszacharidot felszuszpendálunk 10 liter 0,25 mólos vizes nátrium-acetát oldatban, és szobahőmérsékleten 3 órán át kevertetve oldjuk. Az oldatlan részeket 7500g-vel centrifugálva eltávolítjuk, a felülúszóhoz hűtés közben 1/3 térfogat etanolt adunk, és éjszakán át állni hagyjuk, majd a csapadékot centrifugáljuk. A kapott 14,9 g csapadékot 2 liter ionmentes vízben oldjuk, ionmentes vízzel átmossuk egy hidroxil-ciklusú Duolite A—101 D oszlopon majd egy Duolite C—10 oszlopon, így proteinmentes oldatot kapunk. Az oldathoz DEAE-cellulózt adunk, amelyet előzőleg 0,5 n nátrium-hidroxid oldattal kezeltünk, és ionmentes vízzel semlegesre mostunk. Az oldatot éjszakán át 5 °C-on kevertetjük, majd utána üvegszűrőn megszűrjük. A szűrt oldat koncentrációját körülbelül 0,2%-ra állítjuk be, majd nátrium-acetátot adunk hozzá 0,25 mólos koncentráció eléréséig, utána jeges-vizes hűtés közben 5 térfogat %-ig adunk hozzá hideg etanolt, és 3 órán át állni hagyjuk. A csapadékot és a folyadékot 0 °C-on 20 percig 15 000 g-nál centrifugálva választjuk szét. A felülúszó oldathoz 20 térfogat%-ig adunk hideg etanolt.. Jeges vizes hűtés mellett 3 órát hagyjuk állni, majd 0 °C-on centrifugáljuk. A csapadékot ionmentes vízzel szemben dializál- 5 juk, és liofilizálva 3,52 g terméket kapunk. A tisztítási eljárás adatai a 2. táblázatban láthatók. 2. táblázat 10 Kitermelés (g) Cukor (g) Protein (g) Nyers poliszacharid 100 60 14 15 nátrium-acetátos oldás felülúszója 77 57,5 8,1 etanolos frakcionálás 14,3 12,6 1,2 20 kezelés Duolite A—101 D-vel és C-20-szal 11,8 10,9 0,30 DEAE-cellulózos kezelés 7,4 7,29 0,056 25 etanolos frakcionálás 3,52 3,49 _ A mellékelt ábrák: 1. ábra: Az anyag infravörös spektruma. 30 2. ábra: A metilezett anyag magmágneses rezonanciaspektruma. 3. ábra: Az anyag és más daganatellenes anyagok összegeződő hatása. 4. ábra: Az anyag és röntgen-sugárral besugárzott 35 Ehrlich ascites daganatsejtek összegeződő hatása. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás az (I) képlettel ábrázolható ismétlődő 40 elágazó tetraszacharid részekből összekapcsolódó poliszacharid előállítására, amelyben a főláncot ű-l,3-glükozidos kötésekkel kapcsolódó glükózrészek alkotják, és három ilyen ß-\,3-glükozidos kötéssel kapcsolódó glükózrészre jut egy /3-1,6-glükozidos 45 kötéssel kapcsolódó glükózrész, és amelynek átlagos molekulasúlya 2 millió (Bio-Gel A—5 m-en végzett gélszűréssel mérve) vagy legalább 1,5 millió feletti (Bio-Gel A-1,5 m-en végzett gélszűréssel mérve), azzal jellemezve, hogy Coriolus versicolor Iwade 50 FERM-P No. 2743 tenyészet micéliumát forró vizes extrakcióval, etanolos kicsapással, vizes nátrium-acetát oldattal végzett kioldással és ioncserés kezeléssel feldolgozzuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás továbbfejlesz- 55 tése hatóanyagként az 1. igénypont szerint előállított poliszacharidot tartalmazó daganatellenes hatású gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a hatóanyagot a gyógyszerek készítésénél szokásos hordozó, hígító és/vagy egyéb segédanyagokkal 60 keverve gyógyszerré elkészítjük. 3 ábraoldal A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 4 834046 - Zrínyi Nyomda, Budapest
