179041. lajstromszámú szabadalom • Eljárás C-076 vegyületek és azokat tartalmazó féregírtószerek előállítására
17 179041 18 2. táptalaj Paradicsom pép 20 g Módosított keményítő (CPC) 20 g Primér élesztő 10 g Kobalt-klorid • 6H2O 0,005 g Desztillált víz 1000 ml pH = 7,2-7,4 1. példa 5. táptalaj Paradicsom pép 40,0 g Zab-liszt 10.0 g 5 Cerelóz 10,0 g Kukoricalekvár 5,0 g Nyomelem elegy 10,0 ml Desztillált víz 1000 ml pH = 6,8 10 Nyomelem elegy Streptomyces avermitilis MA—4680-t tartalmazó kémcsövet aszeptikusán felnyitunk és a tartalmát egy J5 250 ml-es Erlenmeyer lombikban 50 ml 1. táptalajban szuszpendáljuk. A lombikot 3 napig rázzuk 28 °C-on egy percenként 220 fordulatszámú és 5.08 cm átmérőjű kör alakú pályájú forgó rázó berendezésen. Az inoculum medium 0,2 ml-es adagjával beoltjuk a 3. táptalaj ferdetenyészetét. Az inoculum ferdetenyészetet 28 °C-on 10 napig inkubáljuk és à °C-on tároljuk használat előtt, hogy 4 további 3-as táptalajt tartalmazó ferdetenyészetet beoltsunk vele. Ezeket a ferdetenyészeteket sötétben inkubáljuk 8 napig. Egy ilyen ferdetenyészettel be- 25 oltunk 3 50 ml 4. inoculum tenyészetet tartalmazó 250 ml-es Erlenmeyer lombikct A tenyészeteket tartalmazó lombikokat 2 napig rázzuk 27-28 °C-on 220 percenkénti fordulatszámú és 5,08 cm átmérőjű kör alakú pályájú forgó rázó berendezésen. A lombi- 30 kok tartalmát összeöntjük és 40 ml különböző táptalajokat tartalmazó 250 ml-es Erlenmeyer lombikokba oltjuk (5% inoculum). A 2., 5. és 6. táptalajokat tartalmazó lombikokat 4 napig inkubáljuk 28 °C-on egy percenkénti 220 fordulatszámú 35 5.08 cm átmérőjű kör alakú pályájú forgó rázó berendezésen. A C-076-t tartalmazó kapott lét elkülönítjük és megvizsgáljuk antelmintikus aktivitását. Mindegyik esetben a 6,2 ml lé és a 25 ml fermentlé centrifugálásával kapott szilárd részek teljesen hatásosak egéren az N. dubius féreg fertőzés ellen. 3. táptalaj (ferde tenyészet) Dextróz Bacto aszparigin Dikáliurn-hidrogén-foszfát Bacto agar Desztillált víz pH = 7 4. táptalaj (inoculum táptalaj) Oldható keményítő Ardamin pH NZ amin E Marha kivonat Magnézium-szulfát *7^0 Cerelóz Dinátrium-hidrogénfoszfát Kálium-dihidrogénfoszfát Kalcium-karbonát Desztillált víz pH = 7,0-7,2 10,0g 0,5 g 0,5 g 15,0 g 1000 ml 50 10,0 g 55 5.0 g 5.0 g 3.0 g 0,5 g 1.0 g 60 0,190 g 0,182 g 0,5 g 1000 ml 65 Vas-szulfát *7^0 1000 mg Mangán-szulfát'4H2 O 1000 mg Réz-klorid ‘2^0 (CuClî • 2H2O) 25,0 mg Kaldum-klorid 100,0mg H2BO3 56,0 mg (NH4)2Mo04 • 4H20 19,0 mg Cinkszulfát • 7H2 O 200,0 mg Desztillált víz 1000 ml PH 6. táptalaj CPC ipari keményítő 40,0 g (módosított, CPC Corp.) Desztillációs maradék 7,0 g Autolizált élesztő (Ardamin pH, Yeast Products Inc.) 5,0 g Kobaltklorid • 6H2 O 50,0 mg Desztillációs víz 1000 ml pH = 7,3 2. példa Az 1. példában leírt módon előállított 3. táptalaj négy ferde tenyészetéből egy 0,5 x 1,0 cm-es kaccsal beoltunk egy 50 ml 4. inoculum médiumot tartalmazó 250 ml-es Erlenmeyer lombikot. Az inoculumot tartalmazó lombikot 1 napig rázzuk 27—28 °C-on egy percenként 220 fordulatszámú 5,08 cm átmérőjű kör alakú pályájú rázó berendezésen. Ennek a lombiknak a tartalmával 20 40 ml 2. táptalajt tartalmazó 250 ml-es Erlenmeyer lombikot oltunk be (5% inoculum), 4 napig inkubáljuk 28 °C- on egy 5,08 cm átmérőjű kör alakú pályájú percenként 220 fordulatszámú rázó berendezésen, 19 lombik tartalmát összeöntjük. Az egyesített C-076 vegyületeket tartalmazó fermentléket leszűrjük és így 500 ml szűrletet és 84 g micéliumot kapunk. 78 g micéliumot 1/2 óráig 150 ml acetonnal extrahálunk keverés közben és leszűrjük az elegyet. A szűrési kalácsot 50 ml acetonnal mossuk, és a szűrletet, valamint a mosott részeket egyesítjük és 46,5 ml-re koncentráljuk. 30 ml koncentrátum pH-értékét híg sósav hozzáadásával 4-re állítjuk be cs 3-szor 30 ml adag kloroformmal extraháljuk. Az extraktumokat úgy szárítjuk, hogy száraz „Infusorial Earth” (Super-Cel)-en keresztül leszűrjük, egyesitjük és vákuumban szárazra pároljuk. A C-076 olajos maradék súlya 91,4 mg, feloldjuk annyi kloroformmal, hogy 3 ml oldatot kapjunk és ez a fermentlé térfogatának 1%-át képviseli. Ebben az eljárásban kapott C-076 teljessen hatásos egéren az N. dubius 9
