179041. lajstromszámú szabadalom • Eljárás C-076 vegyületek és azokat tartalmazó féregírtószerek előállítására
179041 22 21 9. táptalaj Dextróz * g/liter Kukoricakeményítő 10 g/liter Húskivonat 3 g/liter Autolizált élesztő (Ardamin pH) 5 g/liter Magnéziumszulfát • 7H2 0 0,05 g/liter Dinátrium-foszfát 0,10 g/liter Dikáliumhidrogén-foszfát 0,182 g/liter Kalciumkarbonát 0,5 g/liter Desztillált víz tetszés szerint pH = 7,0-7,2 D lépés 467 liter 6. táptalajt tartalmazó 766 literes rozsdamentes acél fermentorba 43 liter C lépésből kapott inoculumot adunk. A fermentort 28 °C-on inkubáljuk, 130 percenkénti fordulatszámmal keverjük és 4,7 liter/s légáramlási sebességgel levegőztetjük. E lépés Ezután a fermentlét leszűrjük és a C—076-t tartalmazó szűrési kalácsot vízzel mossuk. A szűrési kalácsot 120 liter acetonban 30 percig szuszpendáljuk, leszűrjük és a kapott anyagot 30 liter acetonnal mossuk. Az acetonos mosás után az anyagokat összeöntjük, csökkentett nyomáson bepároljuk és így a térfogat 40 liter. A koncentrátum pH-ját híg sósav segítségével 4-re állítjuk. A koncentrátumot 3-szor egyforma térfogatú kloroformmal extraháljuk. A kloroformos extraktumokat „Infusorial Earth” (Super-Cel)-en keresztüli szűréssel szárítjuk. Az extraktumokat áteresztjük a Super-Celen, majd összeöntjük. Az összeöntött extraktumokat csökkentett nyomáson 4 literre bepároljuk. A kloroformos koncentrátumot szűrjük, és egy kloroformmal töltött 2,4kg-os szilikagél oszlopon engedjük keresztül. Az oszlopot kloroformmal eluáljuk és nyolc 3,5 literes frakciót szedünk. Az oszlopot ezután kloroform és metanol 49 :1 arányú elegyével eluáljuk és még nyolc további 3,5 literes frakciót szedünk (9—16 frakciók). A 3-as frakciót szárazra pároljuk és 76 g túlnyomórészt C—076-í tartalmazó olajos anyagot kapunk. Az anyag 97%-át 685 ml metilén-kloridban oldjuk és 800 g metakovasavon kromatografáljuk (Mallinckrodt Chemical Co. 100 mech, 80 mesh nyílású szitán újraszitáljuk). A 7,62 cm átmérőjű és 36 cm hosszú oszlopot metilénklorid és benzol 7 :3 arányú elegyével (körülbelül 7,5 liter), majd 2,25 liter metilénklorid és benzol 7 :3 arányú elegyében oldott 5%-os izopropanollal hívjuk elő. A metilénklorid-benzol oldatban 5%os izopropanollal eluált frakció erősen színes sávot tartalmaz, és ez a frakció tartalmazza lényegében az összes C—076 anyagot a vékonyrétegkromatográfia szerint (5. példa). Ezt az 500 ml-es frakciót bepároljuk és 3,7 cm átmérőjű, 18 cm hosszú 105 g metakovasav oszlopon metüénkloridban újra kromatografáljuk. Az oszlopot 5, 10 és 20% étert tartalmazó 100 ml-es metilénklorid adagokkal hívjuk elő. Metilénklorid 20%-os éteres oldatával tovább eluálva 2 színes sávot kapunk. A vékonyrétegkromatográfia szerint a két sáv közötti frakciók tartalmazzák gyakorlatilag az egész C—076 anyagot. A C-076-t tartalmazó frakciót 3,7 cm átmérőjű 11 cm hosszú 59 g metakovasav oszlopon kromatografáljuk metüénkloridban. Az oszlopot metüénklorid 10%-os metüénkloridos oldatával hívjuk elő. Amikor az első anyag elkezd eluálódni először egy 70 ml-es frakciót és utána 26 5—6 ml-es frakciót szedünk. A 3—26 frakciót összeöntjük, 1,35 g anyagot kapunk, melyet szilikagél lemezen vékonyrétegkromatográfiának vetünk alá. (Analte ch GF 254, metüénklorid 5%-os izopropanolos oldatával hívjuk elő). A Rf = 0,28 értékű anyag a C-076 Al. Az oszlopot ezt követően 200 ml metilénklorid 20%-os éteres oldatával, majd 800 ml metilénklorid 50%-os éteres oldatával eluáljuk. Egy kis mennyiségű C-076 A1/A2 elegyet eluálunk, majd a többi C—076 A2. Az egész maradék C—076 A2 frakció 800 mg. Metüénklorid 5%-os izopropanolos oldatával tovább eluálva 135 g C—076 Bl-t kapunk. Az elválasztást az eluáló szer ultraibolya abszorpciójának megfigyelésével követjük nyomon. A C—076 B1 és A2 Rf értékei szilikagél vékonyrétegkromatográfiás lemezeken (Analtech GF 254) metilénklorid 5%-os izopropanolos oldatban igen hasonlóak. A két komponens azonban világosan megkülönböztethető, ha azonos lemezeken hexán 15%-os izopropanolos oldatával hívjuk elő. Az egész C-076 Al frakciót 14 20 x 20 cm 500 u vastag szilikagél lemezre visszük (Analtech HF 254). A lemezeket hexán 10%-os izopropanolos oldatával hívjuk elő. A C—076 Al-t tartalmazó sávot eltávolítjuk a lemezekről, éterrel extraháljuk, bepároljuk és 6 másik lemezre visszük fel ismét, majd 5-ször hívjuk elő hexán 5%-os izopropanolos oldatával. A C-076 Al-t eltávolítjuk a lemezekről, újra kromatografáljuk, tiszta éterrel előhívjuk és üy módon 270 mg tiszta C-076 Al-t kapunk. A minta infravörös színképe és mágneses magrezonanciája az 1. és 5. ábrán, valamint a II. táblázatban látható. A C-076 A2 frakciót 10 szilikagél lemezen kromatografáljuk (Analtech HF 254), 5-ször hívjuk elő hexán 15%-os izopropanolos oldatával. 265 mg tiszta C—076 A2-t kapunk. A minta infravörös és mágneses magrezonancia színképeit a 2. és 6. ábra és a II. táblázat szemlélteti. A C-076 B1 frakciót 2 fenti lemezen kromatografáljuk hexán 15%-os izopropanolos oldatában. 55 mg tiszta C—076 Bl-t kapunk. A minta mágneses magrezonanciáját a 7-es ábrán és a II/táblázatban ábrázoltuk. 5. példa A 4. példában leírt fermentációt kétszer megismételjük és a fermentléket összeöntjük. A fermentlét a 4. példában leírt módon dolgozzuk fel és 3,3 liter 60 mg/ml szüárd terméket tartalmazó kezdeti kloroformos extraktumot kapunk, amely a vékonyrétegkromatográfia szerint 0,5% C-076 vegyületet tartalmaz. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 AS 11
