179013. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A-35512 antibiotikum-keverék előállítására
25 179013 26 Ahogy az a levegőztetett, süllyesztett fermentációknál szokásos, a táptalajon steril levegőt buborékoltatunk át. A mikroorganizmus gyors növekedése érdekében az átáramoltatott levegő mennyiségét előnyösen a táptalaj térfogatára számítva 0,1 térfogat/perc feletti értékre állítjuk be. Az A-35 512 antibiotikumok termelése szempontjából a tankfermentációkkor a levegőztetés előnyösen körülbelül 0,25 térfogat levegő/térfogat táptalaj/perc. A fermentáció során az A—35 512 antibiotikumok termelését a tenyészlé mintáinak vagy a micélium extraktumainak antibiotikum-tartalmának mérésével követjük, a mérést az antibiotikumokra érzékeny tesztorganizmussal végezzük. Az egyik ilyen mérésre használható mikroorganizmus a Bacillus subtilis ATCC 6633. A biológiai értékmérést előnyösen papírkorong-módszerrel, a tápigény szempontjából korlátozott táptalajt tartalmazó agarlemezeken végezzük. A süllyesztett levegőztetett fermentációs körülmények között termelődő A—35 512 antibiotikumokat a fermentációs iparban ismert módszerekkel különítjük el a tenyészléből. Az A—35 512 antibiotikumokat termelő mikroorganizmus által szintetizált antibiotikumok általában a szűrt tenyészlében vannak. Az A-35 512 antibiotikumok maximális kinyerését ezért a micélium eltávolítását célzó szűréssel kezdjük. A szűrt tenyészlé különböző módszerekkel tisztítható az A-35 512 antibiotikum-keverék előállítására. Előnyösen például úgy járunk el, hogy a szűrt tenyészlevet egy poliamid kromatografáló oszlopon adszorbeáljuk, az oszlop eluálását víz és vizes alkohol elegyeivel végezzük. Az antibiotikum-aktivitással rendelkező eluált frakciókat egyesítjük. Eljárhatunk úgy is, hogy azokat az eluátumokat egyesítjük, amelyek a vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat szerint csak egy komponenst tartalmaznak, amikor tisztított A-35 512 B komponenst és más A-35 512 komponensekben gazdag keverékeket kapunk. Az egy A-35 512 komponensek további tisztítását például további adszorpciós és extrakciós eljárásokkal végezhetjük. Adszorptív anyagként használhatunk például alumíniumoxidot, szilikagél ioncserélő gyantát vagy másokat. Az A—35 512 komponensek hidrogénklorid sóikként vannak a tenyészlében. Az előnyösen használható poliamidos elkülönítési eljárás után az A—35 512 B komponenst és a többi A-35 512 kompo- 5 nenst tartalmazó keveréket hidrogénklorídos sóikként kapjuk meg. Mindegyik komponenst átalakíthatjuk szabad bázisaikká (ionos klórtól mentes) ismert eljárásokkal, mint például gyengén bázikus ioncserélő gyantával kivitelezett kromatográfiával. 10 A tenyészlé szilárd maradéka, amely a táptalajösszetevőket és a micéliumot tartalmazza, extrakció vagy elkülönítési eljárások nélkül, de előnyösen a víz eltávolítása után, szintén használható az A-35 512 antibiotikumok forrásául. így például a fermentáció 15 befejezése után a tenyészlevet liofilezéssel száríthatjuk, és közvetlenül keverjük a takarmány premixszel. Az A-35 512 aglikont 'az A-35 512 B komponens enyhén savas körülmények között kivitelezett 20 hidrolízisével állítjuk elő. Az A-35 512 B komponens leginkább dihidrogénkloridos sójaként áll rendelkezésre. Az A-35 512 B komponens dihidrogénklorid sója ezért előnyösen használható fel az A-35 512 B komponens aglikonjának előállítására. 25 Az A—35 512 B vagy a B komponens savaddíciós sóit szintén használhatjuk. A savas hidrolízist ismert eljárások szerint végezzük. A hidrolíziskor bármely savat használhatjuk, előnyösen azonban sósavval végezzük az A—35 512 B komponens aglikonjának 30 előállítását. Ebben az esetben az A-35 512 B aglikont hidrogénkloridos sójaként kapjuk meg. A hidrolízist előnyösen vízben, 1-2 óra közötti időn át reflux alatt végezzük. Hosszabb reakcióidő esetén az ágiikon bomlik, amikor kevésbé aktív, később inak- 35 tív termékhez jutunk. Különleges reakciókörülmények biztosításakor az optimális reakcióidőt a reakcióelegy mintáinak biológiai aktivitás-mérésével határozzuk meg. Az A—35 512 antibiotikum-keverék, az A—35 40 512 antibiotikum faktorok, az A, B, C, E, H és az A-35 512 komponens aglikonja gátolja bizonyos patogén mikroorganizmusok, elsősorban a Gram-pozitív mikroorganizmusok növekedését. Az A-35 512 A, B, C és H komponensek legkisebb növekedés-gát- 45 ló koncentrációit (MIC) (az ismert agar-hígításos módszerrel határoztuk meg) az 5. táblázatban foglaljuk össze. 5. táblázat Minimális növekedésgátló koncentráció Mg/ml Mikroorganizmus A—35512 -HC1 A komponens A—35512 -HC1 B komponens A—35512 • HC1 C komponens A—35512 • HC1 H komponens Staphylococcus aureus 3055 6,25 3,12 6,25 25,0 Staphylococcus aureus 3074 25,0 6,25 6,25 25,0 Streptococcus faecalis 6,25 3,12 3,12 12,5 13
