178808. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új 9-(2-hidroxi-etoxi-metil)-guanin-mono-foszfát-származékok előállítására
178808 8 5. példa Szemcsepp 9-(2-hidroxi-etoxi-metil)-guanin-foszfát-nátriumsó 1,0 g Nátrium-klorid, analitikai tisztaságú 0,0 g Timeroszal (etil-merkuritíoszalidlsav-nátriumsó) x 0,001 g Desztillált víz ad 100 ml Az oldat savasságát 5,5—7,5 közötti pH-értékre állítjuk be. 7 6. példa Befecskendezhető oldat 9-(2-hidroxi-etoxi-metil)-guanin-foszfát-nátriumsó 0,775 g Steril, pirogén anyagoktól mentes, 7-es pH-értékű pufferoldat ad 25 ml 7. példa 9-(2-Hidroxi-etoxi-metil)-guanin--foszfát-dinátriumsó 25 g 9-(2-hidroxi-etoxi-metil)-guanin és 250 ml trietil-foszfát —30 és —20 °C közötti hőmérsékletre hűtött elegyéhez keverés közben 3 óra alatt hozzáadunk 54 ml foszfor-oxi-kloridot. Hagyjuk, hogy a reakcióelegy 45 perc alatt 0 °C-ra melegedjen fel, majd további 45 percig ezen a hőmérsékleten tartjuk. Ezután az elegyet jég és víz elegyébe öntjük, és a pH-t 2 n nátrium-hidroxid oldattal 1 körüli értékre állítjuk be. A kapott oldatot kloroformmal, majd éterrel extraháljuk. A visszamaradó vizes fázis savasságát 6,8 pH-értékre állítjuk be 2 n nátrium-hidroxiddal, majd pedig 7,3 pH-értékre 10 n nátrium-hidroxid oldattal. A végső oldattérfogat 2,5 liter. A semlegesített oldatot 2000 g Dowex 1x8 töltetet tartalmazó oszlopra visszük fel (a töltetet előzetesen egyensúlyba hozzuk 50 millimólos kálium-hidrogén-karbonát oldattal. Lineáris grádiensű elúciót alkalmazunk 50—500 millimólos kálium-hidrogén-karbonát oldattal (30 liter), majd pedig az oszlopot átmossuk 500 millimólos kálium-hidrogén-karbonát oldattal (30 liter). A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, s a kálium-hidrogén-karbonát legnagyobb részét eltávolítjuk Dowex 50—tT gyanta hozzáadásával és a széndioxid vákuumban történő kiűzésével. Az oldat térfogatát vákuumban 2 literre csökkentjük, és a terméket 4°C-on kicsapjuk 10 liter aceton hozzáadásával. A kivált anyagot szárítjuk, és a kapott 55 g terméket 10 cm átmérőjű és 110 cm magasságú Bio-Gel P—2 oszlopra visszük. Az oszlopot vízzel eluáljuk. 22 g szilárd anyagot kapunk, amelyet a savanyú só alakjában kristályosítunk át 4 °C-on a pH = 3 értékű vizes oldatából. További anyagot nyerünk ki az anyalúgból, 20%-os etanolból pH = 3 értéken végzett kristályosítással. A savanyú sót minimális mennyiségű vízben oldjuk, a pH értékét 8,5-re állítjuk be nátrium-hidroxiddal, és az anyagot- kicsapjuk 4 °C-on kétszeres térfogatú etanollal. A csapadékot 100 ml vízben oldjuk, és kicsapjuk kilencszeres térfogatú etanol hozzáadásával 4 °C-on. 15,1 g 9-(2-hidroxi-etoxi-metil)-guanin-monofoszfát-dinátriumsó-dihidrátot kapunk. A termék tisztaságát elemanalízissel, nagynyomású folyadék-kromatográfíával és az ultraibolya spektrum alapján vizsgáltuk. Analízis a C8Hi2N506P Na2 * 2H20 képlet alapján: számított: talált: C =24,94%, N = 18,19%, C =25,20%, N =18,10%, H = 3,66%, P =8,04%, H = 3,63%, P =7,89%. Ultraibolya spektrum: Oldószer max. min. kiszélesedés 0,1 M HC1 pH = 7 0,1 M NaOH 254 12970 249 14060 255-264 11760 225 272 219 266 228 A nagynyomású folyadék-kromatográfiás vizsgálattal meghatározott tisztasága: 99%. Bázis/foszfát arány = 1,00/1,01 A termék 175 °C körül lágyul. Fokozatos bomlás és sötétedés figyelhető meg 250 °C felett. A találmány szerinti vegyületek farmakológiai hatásának alátámasztása céljából a vegyületek aktivitását az úgynevezett PIT (Plaque Inhibition Test) módszerrel vizsgáltuk. PIT-módszer (Plaque Inhibition Test): A PIT-vizsgálatokat VERŐ sejteken végeztük, ahol a sejtek összefüggő mono-rétegét annyi vírussal fertőztük, amennyi összefüggő foltot eredményezett. Egy szilárd fedőréteg rávitele után egy olyan szűrőpapír-korongot helyeztünk a fedőrétegre, amelyet előzőleg a vizsgált vegyület (átlagban 50 Mg hatóanyagot tartalmazó) oldatával itattunk át. A kultúrát 37 °C-on, 96—120 óráig 5% széndioxid-tartalmú atmoszférában inkubáltuko Ezután a sejteket 10%-os formáimnál kezeltük majd metilénkékkel festettük. Az eredmények értékelése: A gátlás mértéke: ++ 25 mm-riél nagyobb átmérőjű zóna + 5—25 mm átmérőjű zóna ± 0-5 mm átmérőjű zóna — negatív 5 10 15 20 2’5 30 35 40 45 50 55 60 65 4
