178485. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antitestek immobilizálására akrilamid alapú polimermátrixban hormonok és gyógyszerek radioimmunlógiai meghatározásánál
3 17S4S5 4 A pohmermátrix kopotimerizádó tévén történő változásával az antitest kötésfajlagosságának nagymértékű növekedését a nem kívánt keresztreakciók visszaszorítását érheljük el. A haptén és az antitest között végbemenő reakció fajlagosságának biztosítása, valamint a keresztreakcióra hajlamos haptének visszatartása céljából a polimennátrixot megfelelő kopolimerizádóval változtathatjuk. A találmány szerinti polimermátrixok a megnövelt fajlagosig alapján lehetővé teszik közvetlenül a nemextrahált szérumban való mérést. A találmány szerinti polimermátrixokkal nagyon pontos radioimmunológiai meghatározás lehetséges, mivel a kopolimerizáció segítségével a szteroidmolekulák és a mátrixok közötti nem-fajlagos kötések révén minimálisra csökken a meghatározási értékek szórása. Különböző meghatározásoknál, mint például a thyroxin és trijódthyronin pajzsmirigyhormonok esetén kompetitiv anyagokat használnak, mint például anüinnaftoszulfonsavat, -mertiolátot vagy -szalidlátot, abból a acélból, hogy a hormonokat a fehérjékből, amelyekhez kötődnek, a szérumba szorítsák ki. Ismert azonban, hogy ilyen kompetitiv anyagok nagy koncentrációban történő alkalmazása esetén a hormon és az antitest közötti kötés kialakulása akadályokba ütközik. A találmány szerinti polimermátrix alkalmazása esetén lehetőség van arra - valószínűleg az elektrosztatikus kölcsönhatások következtében -, hogy a kompetitiv anyagok koncentrációját lényegesen, mégpedig 100-szorosra megnöveljük anélkül, hogy a hormon és az antitest közötti kötés gyengülne. A kopolimerizátumban az akrilamid részaránya 1—99 mól%, előnyösen 5—95 mól%, különösen 20-80 mól% lehet. Különösen alkalmasak akrilamidból és metakrilsavból előállított olyan kopolimerizátumok, ahol a metakrilsav részaránya 20—60 mól%. A metakrilsav egyrészt hidrofóbizálja a mátrixot, másrészt olyan töltéshatást hoz létre, melynek segítségével a vizsgálandó anyag nem-fajlagos kötései kikapcscihatók. Akrilsavat és metakrilsavat, valamint ezek sóit tartalmazó kopolimerizátumok találmány szerinti alkalmazásával elérhető továbbá neutralizációs vagy puffer hatás savas Sietve lúgos oldatok esetén. Ez számos meghatározásnál jelent nagy előnyt. Az akrilsav és metakrilsav sóiként előnyösen alkálifém- vagy alkáliföldfém-sókat használunk. Különösen nátrium- vagy kálium-sókat alkalmazunk. Az akrilsav és metakrilsav származékaiként főként ezek észterei, például metil- és etil-észterei jönnek számításba. A metakrilamid megfelelő származékai például a nitrogénatomon szubsztituált vegyületek, mint például N-hidroximetUmetakrilamid. Az akrilamiddal kopolimerizáló további megfelelő vegyületek az akrilamid származékai, különösen a nitrogénatomon szubsztituált vegyületek, mint például N-hidroximetilakrilamid. Más típusú az akrilamiddal kopolimerizáló vegyidet például az NJ^’-diaOilborkősavdiamíd. Az antitest immdbilizálása azáltal történik, hogy a mátrix az antitestet magába zárja és/vagy az antitest a mátrixon kovalens kötéssel rögzítődik. A radioimmunológiai vizsgálatok részletes leírását tartalmazza például a Chlinical Chemistry, Bd. 19, Nr. 2. 1973, 145. oldala. A Chlinical Chemistry, Vol. 19. Nr. 12, 1973, 1339 oldalán és a Chlinical Chemistry, Vol. 21. Nr. 7, 1975, 829 oldalán olyan radioimmunoiógiai módszereket írnak le, ahol immobolizált antitesteket alkalmaznak. A találmány szerinti polimermátrixok alkalmasak a szérumban vagy a plazmában részben fajlagos illetve nem-fajlagos fehérjékhez kötött különböző hormonok és gyógyszerek meghatározására. Ezek példáiként a következőket hozzuk fel: pajzsmirigyhormonok, különösen thyroxin és trijódthyronin, szteroidhormonok, mint például coristól, testosteron,. progesteron, östron, östradiol és östrial, valamint a szívglükozidok, mint például digitoxin és digoxin. Ezen kívül meghatározhatók vitaminok, különösen a B 12 vitamin és folsav, valamint erős fehérjekötést tartalmazó gyógyszerek, mint például véralvadástgátló szerek, dikumarol, fájdalomcsillapítók és szalicilátok. A' radioimmunológiai meghatározások mellett adott esetben alternatív meghatározási módszerek, mint például a fluorimmunológiai meghatározás vagy az enzimes jelölés segítségével végzett meghatározások is számításba jönnek. Az antigének szintézise, antiszérumoknak például nyulak immunizálása révén történő előállítása és az antitestek izolálása valamint immobizálása már ismert (v. ö. például Chlinical Chemistry, Bd. 19. Nr. 2. 1973, 146.old.). A találmány szerinti, immobilizált antitestet tartalmazó polimermátrixok előállítása történhet például oly módon, hogy az antitest valamely oldatát hozzáadjuk a monomer-keverékhez. A reakcióelegyet például gyökösen polimerizáljuk és a kapott polimerizátumot aprítjuk, mossuk és szárítjuk. Az akrilamidhoz hozzáadott kopolimer kiválasztása és részaránya aszerint változik, hogy a fajlagosság szempontjából milyen tulajdonságokat akarunk elérni a polimermátrixnál. A fajlagosságot a mátrix hidrofobidtása és töltése változtatásával nagymértékben befolyásolhatjuk. Akrilsav, metakrilsav vagy ezek sóinak az alkalmazása a mátrix töltését változtatja meg. Lehetőség van arra is, hogy az akrilsav vagy a metakrilsav sóit közvetlenül a monomerkeverékhez adjuk hozzá vagy ezzel egyenértékűen a savakat polimerizáljuk, majd a polimermátrixban ioncsere révén kialakítjuk a sókat. A polimermátrix megfelelő pórusméretének elérése céljából a monomerkoncentrációt változtatjuk. Mintegy 20% monomerkoncentrádónál körülbelül 7—10 Â pórusméret érhető el. Előnyös például az akrilamidból és 20—60 mól% akrilsavból és/vagy metakrilsavból álló kopolimerizátum, melyet mintegy 20%-os olyan monomeroldatból állítunk elő, melyben a savas csoportoknak legalább egy része alkálifém- illetve alkáliföldfém-só alakjában van jelen. A találmányt a következő példákkal világítjuk meg közelebbről. 5 10 15 30 25 30 35 10 45 50 !55 60 65 7
