178405. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ergornin és béta-ergokriptin fermentációs előállítására
3 178405 4 középen kicsúcsosodó, sugarasan ráncolt 20— 25 mm-es lilás-rózsaszín telepek. A telep hátoldala sötétbarna, a telep körül a táptalaj liiásan elszíneződő. Maláta agar táptalajon a törzs telepei: 10 napos korban: 1—2 mm átmérőjű szabályos félgömbalakú telepek, színük világos drapp. 20 napos korban : a telepek növekedése gyenge, átmérőjük 2—4 mm. Színük barnás árnyalatúra sötétedik. St agar táptalajon a törzs telepei : 10 napos korban: határozott szélű, közép felé átlósan ráncolt, középen csúcsosan kiemelkedő, 8—12 mm átmérőjű telepek. A csúcs magassága 3—5 mm. Színük drapp—világosbarna. 20 napos korban : a telepek felülete erősen, a szélek felé elágazóan barázdált. A csúcs kráterszerűen kitüremkedő. Színük világosbarna, kakaós árnyalattal. A telepek átmérője változó, 25—40 mm, magasságuk 6—8 mm. Az agar felületéről nehezen választhatók el. A telepek spórát nem képeznek. Folyékony kultúrában a törzs mikroszkópos megjelenése. GK táptalajon 40 órás tenyészetben : kis sejtszámú telepek, illetőleg nagyrészben egyedi sejtek. A sejtek 4—8 x 8—20 fx méretűek, cilindrikus, lekerekedő, vagy szabálytalan alakúak, sejtvégi és oldalági osztódások egyaránt gyakran megfigyelhetők. A sejtsorok rövidek, néhány sejtből állnak. Fáziskontraszt mikroszkópos megfigyeléssel a sejtek erősen szemcsézettek, az idősebb sejtek vakuólomokat tartalmaznak. Spóraképződés nincs. St táptalajon 40 órás tenyészetben: A mikroszkópos megjelenés jellegében fentivel azonos, eltérés, hogy ezen a táptalajon gyakoribb a telep, illetve sejtsor képződés, az egyes sejtek mérete a nagyobb értékek felé eltelt, öregedő sejtekben sem figyelhető meg vakuólum. A makroszkopikus és mikroszkopikus megjelenés vizsgálatánál használt táptalajok közül az St, az St-agar és a Gk táptalajok összetételét a példákban fogjuk ismertetni. A keményítő-triptofános agar táptalaj összetétele a következő: keményítő: 20 g triptofán 1 g káliumklorid 1 g diammóniumhidrogénfoszfát 2 g A pH értékét 6,6—6,8-ra állítjuk be, majd a térfogatot vízzel 1000 ml-re töltjük fel; a kapott folyékony táptalajhoz 25 g agar port (Difco) adunk, felfőzzük, 150 ml-enként palackokba töltjük, sterilezzük. A maláta agar-táptalaj összetétele malátakivonat 60g víz ad 1000 ml agar-por (Difco) 25g A táptalajt felfőzzük, 150 ml-enként palackokba töltjük, sterilezzük. A törzs biokémiai jellemzői: Szacharózt béta-frukto-furanozidáz enzimmel bont, mellyel transzfer oligoszacharidokat képez. Citromsavat jól hasznosítja. Antrachinon jellegű pigmentet termel, elsősorban hidroxiantrachinonokat. Az új törzs irodalomból ismert, cukrot és szerves sav ammóniumsóját tartalmazó táptalajokon tenyészve alkaloidot termel, a képződő alkaloid 25—30%-a ß-ergokriptin, az alkaloid zöme, 55—60% ergokornin, a fennmaradó hányad a-ergokriptin. A jellemző peptidalkaloidokon kívül csak ergometrin termelésére képes. A fentiekben leírt új Claviceps purpurea variáns törzset 1979. május 9-én 00186 MNG számon deponáltuk. Az MNG 00186 számon letétbe helyezett törzs alkalmazási területeit vizsgálva azt találtuk, hogy aerob körülmények között, szén és nitrogénforrást, ásványi sókat és adott esetben egyéb adalékokat tartalmazó táptalajon végzett fermentációban a törzs alkalmas az ergotoxin bizonyos komponenseinek, nevezetesen az ergokornin, a- és ß-ergokriptin termelésére. Azt találtuk továbbá, hogy ha az új variáns törzzsel végeztetjük az alkaloid-termelést és közben a fermentléhez a keletkező vegyületek prekurzoraként valint és/vagy izoleucint adunk, akkor nő a fermentlében a termelt alkaloidok mennyisége. A találmány tárgya eljárás anyarozsalkaloidok, főként ergokornin és ß-ergokriptin előállítására Claviceps purpurea törzzsel aerob körülmények között, szén-, és nitrogénforrást, ásványi sókat és adott esetben egyéb adaléko(ka)t tartalmazó táptalajon végzett fermentáció útján, azzal jellemezve, hogy tenyésztett törzsként MNG 00186 számon letétbe helyezett Claviceps purpurea variánst alkalmazunk. A találmány értelmében a fermentációt alámerülő kultúrában, aerob körülmények között, szén- és nitrogénforrást, ásványi sókat és adott esetben egyéb adalékokat tartalmazó folyékony táptalajon végezzük. A fermentációt 20—26 °C közötti hőmérsékleten, 5,2 és 6,8 közötti pH értéken, 4—8 napon át végezzük. A fermentációban adott esetben a termelt alkaloidok mennyiségét növelő adalékot (prekurzort), így valint és/vagy izoleucint alkalmazunk. A prekurzort 0,05—0,5 g/100 ml, előnyösen 0,1— 0,3 g/100 ml fermentlé mennyiségben alkalmazzuk vizes vagy gyengén savas-vizes oldatban, melyet sterilezés után adagolunk a fermentléhez. Az adagolás történhet egyszeri adagban, több adagra elosztva, vagy a fermentáció valamely periódusában folyamatosan. A fermentlevekben színreakció alapján fotometrikusan összalkaloid tartalmat is mértünk; ezt nem tartjuk specifikusnak, de korábbi bejelentések példái gyakran adják meg a termelési szintet spektrofotometriával nyert összalkaloid értékben. A fermentáció jellemzésére az egyes ergotoxin komponenseket külön határoztuk meg eluációs kromatográfiával vagy kvantitatív folyadékkromatográfiával. A törzs alkalmazásának előnyei az eddig ismert eljárásokhoz képest 1. Drogextrakciós eljárással összevetve a fermentációs úton történő termelés fejlettebb műszaki megoldás, nem hordozza a mezőgazdasági együttműködés általános hátrányait és közvetlen műszaki beavatkozással sarzsonként irányítható. 2. A fermentációs gyártás egyszerű ipari anyagokból (szacharóz, ammónia) az élő sejt segítségével 24 °C-on, levegő hozzáadásával állítja elő á bonyolult molékulát a hosszú reakciósorból felépített félszintetikus éljárás5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
