178404. lajstromszámú szabadalom • Eljárás magas heparintartalmu szervkivonatok előállítására
7 178404 8 könyvi minőségű heparin izolálása tetszés szerinti ismert módszerrel jó hatásfokkal megoldható. Ha a találmány szerinti eljárás kivitelezésére a 159 977 lajstromszámú magyar szabadalmi leírásban ismertetett U-extraktort alkalmazzuk és 50 °C hőmérsékletű 0,5—1,0 n koncentrációjú, legalább 5% nátriumkloridot tartalmazó extraháló oldattal végezzük a kivonatolást az extraktorban 30 perc tartózkodási idő mellett, akkor a heparintartalmú szervkoncentrátumból a hatóanyag a legteljesebb mértékben extrahálható. A szárított szervkoncentrátum és az extrakciós folyadék arányát 1 : 5-re állítjuk be. A nagy fajlagos felületű szervkoncentrátum vízfelvétellel enyhén duzzad, de alaktartó szemcsés jellegét, kitűnő szűrhetőségét megőrzi még a magas lúgkoncentráció mellett is. A lúgkoncentráció növelése gyakorlatilag alig befolyásolja az oldatba kerülő nem heparin-jellegű szerves szárazanyag-tartalom mennyiségét, illetve gyakorlatilag nem változik az oldatba kerülő fehérjék, illetve peptidek mennyisége sem. Ennek oka feltehetően az extrahálandó szerv főtömegét kitevő fehérjéknek a szárítás során bekövetkező nagymértékű és irreverzíbilisen végbemenő denaturációja. A találmány szerinti eljárást közelebbről a kiviteli példákban ismertetjük. Megjegyezzük, hogy néhány összehasonlító példát is leírunk e találmány szerinti extrakciós eljárás előnyeinek bemutatására. 1. példa (összehasonlító) Heparintartalmú nyersanyagként a következő módon előkészített anyagot alkalmaztuk : Heparintartalmú állati szerveket aprítás után vizes közegben 36—42 °C közötti hőmérsékleten 4—6 óra hosszat tartottuk, majd az előkezelt szuszpenzióból 100 °C-ig terjedő hőmérsékletig vízoldhatatlan heparinfehérje-tartalmú komplexet választottuk le. A komplexet hőkezeléssel jól kezelhető aggregátumokká alakítottuk át, a kivált csapadékot elkülönítettük és az izolált heparintartalmú nyersanyagot 95 súly% azárazanyagtartalom eléréséig 100 °C alatti hőmérsékleten szárítottuk. Morzsalékos, alaktartó terméket ismert módon autolízissel, toluol jelenlétében elektrolitoldatok felhasználásával kivonatoljuk. 20 kg előbbi minőségű heparin nyersanyagot 100 kg 18% szárazanyagtartalmú finomra darált sertés vékonybéllel 450 liter vízzel és 150 liter 10%-os ammóniumszulfát-oldattal keverős duplikátorban intenzíven összekeverünk. Keverés után az elegyet 38 °C-ra felmelegitjük. 38 °C elérése után keverés közben 40%-os nátriumhidroxiddal 8,8—9,2 közötti pH-értéket állítunk be és a káros mikrobiológiai folyamatok megelőzése céljából 3 liter toluolt adagolunk a rendszerbe. A hozzáadott enzimekkel az autolízist 36 óra hosszat végezzük, a hőmérsékletet 38 °C-on tartjuk, a rendszert időszakonként átkeverjük. A pH-értéket 6 óránként ellenőrizzük és szükséges esetben 40%-os nátriumhidroxiddal a megadott pH-értéket fenntartjuk. 36 órás autolízis után 18%-os sósavval 7,3—7,7 közötti pH-értéket állítunk be és az elegyet felforraljuk. 10 perces forralás után a hőhatásra iners részek koagulálódnak, ezeket szűrőszitán elválasztottuk. A szűrletet 60 °C-on szeparálással zsírmentesítettük. A kapott sötétbarna színű extraktlé 638 liter térfogatú, heparinkoncentrációja 18,1 NE/ml, ez 11,54 MNE heparinnak felel meg. Az 5. példával összehasonlítva a hozam mindössze 76%. 2. példa (Összehasonlító) Az előbbi minőségű újtípusú heparin alapanyagot a 3 817 831 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás 1. példája szerint kivonatoljuk. 40 kg alapanyagot keverős duplikátorban 400 liter vízzel alaposan elkeverünk, a pH-értéket sósavval 2,7-re állítjuk be és az elegyet 38 °C-ra felmelegítjük. 10 kg sertésgyomor-nyálkahártyának megfelelő pepszint adunk hozzá és a pH- értéket az előbbire ismét beállítjuk. A proteolízist 20 óra hosszat végezzük állandó keverés közben, a hőmérsékletet 37—39 °C között tartjuk. 20 órás proteolízis után 40%-os nátriumhidroxiadal 8,0 pH-értéket és 37 °C hőmérsékletet állítunk be, majd 20 liter aktivált pankreász-keveréket adagolunk. A második proteolízist 10 óra hosszat végezzük, a pH-értéket 2 óránként ellenőrizzük és szükséges esetben a megadott 8 pH-értéket — nátriumhidroxid adagolásával — fenntartjuk. A hőmérsékletet 37 °C-ra állítjuk be. A második proteolízis után az elegyet felforraljuk, majd szűrőszitán szűrjük. Az így kapott barna színű szűrlet térfogata 417 liter, heparinkoncentrációja 32,0 NE/ml, ami 13,32 MNE heparinnak felel meg. Az 5. példával összehasonlítva a kitermelés 62,7%. 3. példa (Összehasonlító) Az 1. példa szerint meghatározott minőségű heparin nyersanyagot a 148 776 lajstromszámú magyar szabadalomban leírt eljárással dolgozzuk fel. 11,2 kg nyersanyagot keverős duplikátorban 195 liter vízzel alaposan elkeverjük, 6,5 kg nátriumkloridot adagolunk hozzá, majd 40%-os nátriumhidroxiddal 10pH-értékre állítjuk be. Egyenletes kevertetés mellett gőzzel az elegy hőmérsékletét 65 cC-ra emeljük, ezen a hőmérsékleten peroxiddal kezeljük, 250 ml 40%-os hidrogénperoxidot vízzel 4 literre felhígítottunk, majd a hígított elegyből 1 litert az elegyhez keverünk. A maradék 3 litert 65 °C hőmérséklet fenntartása mellett 30 perc leforgása alatt egyenletesen adagoljuk a készülékbe. A peroxidos kezelés után 65 °C-on 1 óra hosszat kevertetjük az elegyet, 600 g ammóniumkloridot adunk hozzá, amikor az elegy 8,7 pH-értékre áll be. A duplikátor köpeny fűtésé vei forralásig felmelegítettük az elegyet, 5 perces forralás után a fűtést és a keverést megszüntetjük. Az elegyet 15 percig ülepítjük, a készülék aljára kiülepedő extrahált szervmaradék fölött elhelyezkedő világossárga, teljesen átlátszó folyadékot a készülék oldalán elhelyezett ürítőcsonk segítségével dekantáljuk. Dekantálás után a készülék körülbelül 1/4 részében elhelyezkedő szervmaradék és a vizes kivonat elegyét felkeverés után 0,8 mm lyukbőséggel rendelkező szűrőszitára folyatjuk. Az egyesített kivonatok térfogata 168 liter, heparinkoncentrációja 32,4 NE/ml, ami 5,44 MNE teljes heparinkihozatalt jelent. A kihozatal az 5. példához képest mindössze 72,4%. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
