178359. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a C-15003 jelű antibiotikum előállítására
7 178359 8 rövid sejtekre képesek felhasadni, ismét másik kevés fehér légmicéliumot tartalmaznak, vagy lényegében légmicélium nélküliek. Az ilyen, C—15 003 antibiotikumot termelő törzsek tenyésztésére felhasznált táptalaj bármely cseppfolyós vagy szilárd táptalaj lehet, azzal a feltétellel, hogy olyan tápanyagokat tartalmaz, amelyeket a törzs hasznosítani képes, bár nagyüzemi termelés esetében a folyékony táptalajok használata kedvezőbb. A táptalajok tartalmazhatnak nitrogén- és szénforrásokat, amelyeket a C—15 003 számú mikroorganizmus képes asszimilálni és emészteni, szervetlen anyagokat, nyomnyi mennyiségű tápsókat és egyéb anyagokat. Szénforrásként például a következő anyagokat használhatjuk: glükóz, iaktóz, szacharóz, maltóz, dextrin, keményítő, glicerol, mannitol, szorbitol, zsírok és olajok (például szójabab olaj, disznózsír, csirkezsír). Nitrogén forrásként például a következő vegyületeket használhatjuk: hús extraktum, élesztő extraktum, szárított élesztő, szójabab liszt, kukoricacsávázó folyadék, pepton, lenmag liszt, maláta hulladék, karbamid, ammóniumsók (például ammóniumszulfát, ammóniumklorid, ammóniumnitrát, ammóniumacetát). A táptalaj ezen felül tartalmazhat nátrium-, kálium-, kalcium-, magnézium- és egyéb sókat, így vas-, mangán-, cink-, kobalt-, nikkelsókat, foszforsav-, bórsav-sókat és szerves savak sóit, így acetátokat és propionátokat. A táptalaj ezen kívül tartalmazhat még különféle aminosavakat (például glutaminsav, alanin, glicin, lizin, metionin, prolin), peptideket (például dipeptidek, tripeptidek), vitaminokat (például Bl5 B2 vitaminok, nitorinsav, B12, C és E vitaminok), nukleinsavakat (például purin, pirimidin és származékaik). A táptalaj pH-értékének beállítása céljából egy szervetlen vagy szerves savat, lúgot, puffereket és hasonló anyagokat adhatunk a rendszerhez. Habzásgátlóként olajok, zsírok, felületaktív szerek és más megfelelő anyagok alkalmas mennyiségeit használhatjuk. A tenyésztést bármely stacioner, rázó, merülő eerob és más módszerrel végezhetjük. Nagyüzemi termelésre természetesen a merülő aerob tenyészetek a legalkalmasabbak. Míg a tenyésztés körülményei természetesen függnek a táptalaj összetételétől, a törzstől, az alkalmazott módszertől és más tényezőktől, általában az inkubálást előnyösen 20 és 35 C között, megközelítőleg 7,0 kezdeti pH-érték mellett végezzük. Különösen kívánatos, hogy a hőmérséklet 23 és 30 °C között legyen a tenyésztés közbenső szakaszában és a kezdeti pH- érték 6,5 és 7,5 között változzon. Bár az inkubálás ideje szintén a fenti tényezők függvénye, tanácsos az inkubálást addig végezni, míg a kívánt antibiotikum titer-értéke maximális nem lesz. Rázó kultúrák vagy aerob merülő tenyészetek esetében ez az idő általában 48—144 óra között van. Az antibiotikum potenciálját Tetrahymena pyriformis W-al vizsgáltuk. így, a fenti mikroorganizmust egy vizsgálati táptalajon [20 g proteóz-pepton (Difco), 1 g élesztő extraktum (Difco), 2 g glükóz, 1000 ml desztillált víz és 10 ml 1 mólos foszfát puffer (pH 7)] 28 cC-on, 44—48 órán át tenyésztettük és az antibiotikum potenciálját sorozat hígításos módszerrel határoztuk meg, nyomonkövetve a zavarosodás változását, megvizsgáltuk a hasvízkór daganatsejtjeire kifejtett hatást és a későbbiekben leírt módon vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatokat végeztünk. i Az új C—15 003 P- 3, P 3 és/vagy P—4 antibjo tikumokat a kapott táptalajon termeljük és gyűjtjük össze, extra- és intracellulárisan egyaránt. Ezeket az anyagokat vékonyrétegkromatográfiásan 5 is kimutattuk. így a fermentlét sejtekre és szűrletre különítettük el szűréssel vagy centrifugálással és a szürletet azonos mennyiségű etilacetáttal extraháltuk A sejtekhez ugyanolyan mennyiségű 70%-os aceton-vfe elegyet adunk mint a szűrlethez és egy órás, 20 °C-on 10 végzett keverés után a szuszpenziót szűrtük. Az acetont eltávolítottuk a szűrletből és a kapott vizes szűrletet etilacetáttal extraháltuk. Valamennyi extraktumot 1/100 térfogatra koncentráltunk és vékonyrétegkromatográfiás méréssel vizsgáltunk, szilikagél lemezen (Merck 15 NSzK, Kieselgel 60 F 254, 0,25 mm, 20 x 20). Oldószerrendszerként kloroform és metanol 9:1 arányú elegyét használtuk. A potenciált a foltok intenzitásának alapján határoztuk meg, amit 2537 A-nél ultraibolyafénnyel végzett besugárzással határoztunk meg. 20 Miután a C—15 003, P—3, P—3' és/vagy P—4 antibiotikumok, melyeket a fermentlében a fentiek szerint állítunk elő, semleges anyagok, könnyen kinyerhetők általánosan használt elkülönítési és tisztítási eljárásokkal, amelyeket rendszerint ilyen típusú 25 szervezetek begyűjtésére alkalmazunk. így például használhatjuk azt az eljárást, amely az antibiotikum és a szennyezések oldhatóságában mutatkozó különbséget hasznosítja, azaz, amely a különféle adszorbensekkel szemben mutatott adszoptív addinitást haszno- 30 sítja (ilyen adszorbensek lehetnek például: aktív szén, makropórusos, nem-ionos gyanták, szilikagél, alumíniumoxíd). A szennyezések ezen kívül ioncserélő gyantákkal és más módszerekkel is eltávolithatók, amelyeket egymagukban vagy alkalmas kombináció- 35 ban, adott esetben ismételten is alkalmazunk. Miután az említett C—15 003, P—3, P—3' és P—4 antibiotikumok a szűrletben és a sejtekben egyaránt előfordulnak, az antibiotikumok elkülönítése és tisztítása ilyen adszorbensek segítségével, ha használatukra 40 egyáltalán sor kerül, történhet akár közvetlenül, akár — szűrlet esetében — oldószeres extrakció, vagy — mikrobiológiai sejtek esetében — oldószeres extrakció után. Az oldószeres extrakciót a következő módszerek bármelyike szerint végrehajthatjuk : 45 (1) a fermentlé oldószeres extrakciója a sejtek elkülönítése előtt, (2) a sejtek és a szűréssel, centrifugálással vagy más módszerekkel kapott szűrlet oldószeres extrakciója. A szűrlet és a sejtek független extrakciójára előnyösen a 50 következő eljárást használjuk. A szürlet extrakciójára alkalmas oldószerek vízzé nem elegyedő, szerves oldószerek, így zsírsav-észtere . például etilacetát, amilacetát; alkoholok, példau butanol; halogénezett szénhidrogének, például ko roform és ketonok, például metil-izobutil-keton. Azex trakciót semlegeshez közeli pH-értéken hajtjuk végre és előnyösen, az előzőleg pH 7-re beállított folyó on> fermentlét etilacetáttal extraháljuk. Az extraktumo vízzel mossuk és csökkentett nyomáson koncentra ju Ezután egy nem poláros oldószert, így petro ete vagy hexánt adunk a koncentrátumhoz és a hatóan)^ got tartalmazó nyersterméket kinyerjük. Mivel ve 0^ rétegkromatográfiás mérések szerint a C— 15 00 lett számos más foltot is kapunk, az I általános P terméket több lépcsőben a következő tisztítási e j 4
