178336. lajstromszámú szabadalom • Eljárás D-karbamil-aminosavak és a megfelelő D-aminosavak előállítására
3 178336 4 L-hidantoin egyidejűleg racemizálódik. Ezt a folyamatot a 2. reakcióvázlat szemlélteti. Ezen oknál fogva a D-hidantoin enzimatikus hidrolízissel történő folyamatos átalakulásával a reakció végeredménye az, hogy az összes karbamil-származék a D- módosulatban hasznosítható. Az L-hidantoin racemizálási sebességére a hőmérséklet és a pH egyaránt lényeges befolyást gyakorol, és ez annál nagyobb, minél magasabb a hőmérséklet és minél bázikusabb a pH. Azonban 8,5 pH körül dolgozva a reakciósebesség akkora, hogy nem képez egy, a reakció sebességét determináló lépést. Ezen túlmenően megállapítottuk még azt is, hogy a D-karbamil-származék vízben oldódik, és forrásig hevítve a 3. reakcióvázlat szerint felbomlik, így optikailag aktív aminosav keletkezik, mely igen nagy kémiai és optikai tisztaságban különíthető el. Végezetül, a találmány további technikai és gazdaságossági előnye abban van, hogy az eljárás a 836.462 számú olasz szabadalmi leírás szerinti, szálas szerkezetű anyagra felvitt enzimmel is lefolytatható. Ellentétben a többi eljárással, amelyeknél az enzim csak egyszer használható, ezzel a módszerrel az enzim ismételten felhasználható, így a művelet költségei csökkenthetők. Továbbá, a reakció tisztább körülmények között megy végbe, minthogy a reakcióelegyben enzimfehérje nem marad vissza. A következő példák a találmány szemléltetésére szolgálnak, anélkül, hogy azt korlátoznánk. 1. példa 176 g (1 mól) D,L-5-fenil-hidantoint 7,5 liter 0,1 mólos kálium-foszfát pufferoldatban 8,5 pH-n, 30 °C hőmérsékleten szuszpendálunk. A szuszpenzióhoz keverés közben 125 ml májból extrahált hidropirimidin-hidroláz oldatot adunk. (Teljes aktivitás 1875 mikromól/perc 30 °C-on; pH=8,5; összes fehérje 2,75 g.) Mintegy 6 óra eltelte után, miközben a rendszer pH- ját 250 ml 4 mólos nátrium-hidroxid-oldat hozzáadásával állandó értéken tartottuk, a reakciót megszakítjuk, a reakcióelegyet 4 °C hőmérsékletre hűtjük, és 6 N sósav-oldat hozzáadásával a pH-t 5,5-re beállítjuk. Ezen művelet közben a denaturált fehérje nyálkás csapadékként kiválik, melyet centrifugálással eltávolítunk. A folyadékot ismét 4 °C hőmérsékletre hűtjük, és 6 N sósav-oldattal 2,5 pH-ra beállítjuk. A savazással kicsapódott kristályos terméket 1 liter hideg vízzel mossuk, és állandó súlyig szárítjuk. A terméket melegen etanol-víz 70: 30 térfogatarányú elegyből átkristályosítjuk. A kapott 189 g anyag (97%-os kitermelés) kromatográfiailag egységes, IR- NMR- és tömegspektrum, valamint elementáranalízis alapján N-karbamil-fenil-glicin. Fajlagos optikai forgatóképesség: Md =137° (C= = 1%, 1 N ammónium-hidroxidban), mely megfelel az irodalomban T. Suzuki, K. Igarashi, K. Hase: Agr. Biol. Chem. 37 (2), 411—416 (1973) által D(-)-N-karbamil-fenil-glicinre közölt adattal. 2. példa Hőszabályozó köpennyel, nitrogénbevezetővel, pH- elektróddal és nátrium-hidroxid-oldat adagolására alkalmas nyílással ellátott reaktorba bemérünk 10 liter 0,1 mólos foszfát-puffer-oldatot, mely májból extrahált hidropirimidin-hidrolázt tartalmaz. (Összes aktivitás 7500 mikromól/perc; összes fehérje: 11 g.) Az oldathoz 30 perces nitrogénbevezetés után, 30 °C hőmérsékleten, 192 g (1 mól) D,L-5-p-hidroxi-fenil-hidantoint adunk, miközben 4 mólos nátrium-hidroxid-oldat folyamatos hozzáadásával a pH-t állandó értéken tartjuk. 20 óra után, miközben 250 ml nátrium-hidroxid-oldat elfogyott, a D(—)-N-karbamil-p-hidroxi-fenil-glicin kipreparálását az 1. példában megadott módon elvégezzük. A kapott nyers terméket etanol és n-hexán elegyből átkristályosítjuk. Az eljárással 152 g (kitermelés 72%) terméket kapunk, melynek tulajdonságai a következők: olvadáspont: 170 °C; [ix]20= —170° (C=0,5%; 50: 50 térfogatarányú víz : alkohol elegyben). A termék szerkezetét elemi analízissel, IR-, NMR- és tömegspektrummal azonosítottuk, az eredmények megegyeznek az irodalomban közölt adatokkal; J. Eagles, W. M. Laird, E. C. Matais: Biochemical Journal, 121, 425—430 (1971) Sup. Publ. No. SUP 50003, Annex 1, Annex 2. 3. példa 206 g (1 mól) D,L-5-p-metoxi-fenil-hidantoint 10 liter 0,1 mólos kálium-foszfát pufferben 8,5 pH-n, és 30 °C hőmérsékleten szuszpendálunk, mely májból extrahált hidropirimidin-hidrolázt tartalmaz. (Összes aktivitás: 7500 mikromól/perc; összes fehérje: 11 g.) A pH-t 4 mólos nátrium-hidroxid-oldat folyamatos adagolásával állandó értéken tartjuk. 20 óra után, miközben 250 ml nátrium-hidroxid-oldat elfogyott, a reakciót megszakítjuk és a D(—)-N-karbamil-p-metoxi-fenil-glicint 90%-os kitermeléssel az 1. példában leírt módon kinyerjük. A termék szerkezetét elemi analízissel, IR-, NMR- és tömegspektrummal azonosítottuk. 4. példa Májból extrahált 230 ml hidropirimidin-hidroláz-oldatot (aktivitása 10 800 mikromól/perc; fehérje: 3,45 g) erős keverés közben 150 g cellulóz-triacetátot tartalmazó 2,1 kg metilén-klorid-oldathoz adunk. Az így kapott emulziót a 836 462 számú olasz szabadalmi leírásban leírt módon kicentrifugáljuk. A kapott 300 g szálas anyagot egyszerű gombolyag formájában egy köpenyes üvegkolonnába (átmérő= =8 cm, magasság=60 cm) tesszük, melyet mindkét végén két saválló acél kengyeles lappal lezárunk. A szálas anyagot ezután 4 liter 0,1 mólos kálium-foszfát pufferoldat, pH 8,5, cirkuláltatásával addig mossuk, míg az oldat enzimaktivitást már nem mutat (4 mosás, összesen 6 óra). A szálas anyaggal töltött oszlopot ezután a reakcióelegy cirkuláltatására egy perisztaltikus szivattyúval, és folyamatos pH-mérésre elektróddal, valamint 4 mólos nátrium-hidroxid-oldat adagolására alkalmas bevezetővel ellátott köpenyes tartállyal összekapcsoljuk. A rendszerbe 5 liter 0,02 mólos kálium-foszfát pufferoldat, 8,5 pH és 176 g (1 mól) D,L-5-fenil-hidantoint vezetünk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
