178140. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L- izoleucin előállítására
3 178140 4 Ezt a célt úgy érjük el, hogy abban az eljárásban, amely szerint L-izdeucin előállítása érdekében a Brevibacterium flavum mikroorganizmust szén-forrást, nitrogén-forrást, ásványi sókat és vitaminokat tartalmazó táptalajon tenyésztik, a találmány szerint a VNIIGenelika 10-89 Brevibacterium flavum mutáns törzset tenyésztjük levegőztetés mellett A VNlIGenetika az ADunion-Forschun^institut für Genetik und Selektion Industrieller Mikroorganismen nevű intézmény rövidített neve. Az előbbiekben megnevezett mutáns törzset nemrég állítottuk elő, A VNlIGenetika intézet ipari mikroorganizmusokat őrző központi tárában (rövidtett nevén CMPM) CMPM B—1507 szám alatt letétbe helyeztük, és ott megkapható. A nevezett törzs 17 g/liter vagy ennél nagyobb mennyiségben képes Gizdeucint termelni. A nevezett törzs különös előnye, hogy egyszerűbb összetételű táptalajon is tenyészthető, és nem szükséges hozzá előanyag. Ezenkívül a nevezett törzset egyszerű eljárással nyerjük, mivel csak G izoleu cin-analógokat alkalmazunk. Fentiek alapján a találmány tárgya Gizoleucin előállítása oly módon, hogy a VNlIGenetika 10—89 Brevibacterium flavum mutáns törzset szén-forrást, nitrogénforrást, ásványi sókat és vitaminokat tartalmazó táptalajon tenyésztjük. A VNlIGenetika Brevibacterium flavum mutáns törzset az ismert Brevibacterium flavum 178 törzsből nyertük, amely Glizint termel, és abban különbözik a vad típustól, hogy homoszerint igé nyel. A Brevibacterium flavum 178 törzs CMPM B-1005, a vad típus CMPM B-42 szám alatt a VNlIGenetika intézet ipari mikroorganizmusokat őrző központi tárában megtalálható. A VNlIGenetika 10-89 (CMPM B-1507) törzset a következőképpen állítottuk elő. A Brevibacterium flavum 178 törzs sejtjeit, amelyek növekedéséhez homoszerin szükséges, 18-20 óra hosszat tejes értékű agar-táptalajon tenyésztettük, és mutagén hatásként a következő módon dietilszulfát gőzzel kezeltük. 0,05 ml térfogatú dietil-szulfát cseppecskét vittünk a 20 ml térfogatú kémcső belső felületére, amelyben a ferde-agar tenyészetet tartottuk. A kémcsövet vattacsomóval lezártuk, és 30°Gon 6 óra hosszat állni hagytuk Ezután a sejteket oltókaccsal a ferde agar felületéről levettük, és fiziológiás oldatban oly módon szuszpendáltuk, hogy a sejtkoncentráció 1,108 legyen. Az így kapott szuszpenziót homoszerint nem tartalmazó agaros mi ni mái-táptalajjal egy csészébe öntöttük. 5 napig, 30 °C-on tároltuk, majd a kifejlődött revertáns telepeket különválasztottuk, és megvizsgáltuk L-izoleucintermelő képességüket dyan táptalajon, amely szén-forrást, nitrogén-forrást, ásványi sókat és vitaminokat tartalmazott. Egy ilyen vizsgálat eredményeként sikerült egy mutánst elkülöníteni, amely lizin-termelő képességét elvesztette, és néhány gramm L-izoleucint termelt. Az elkülönített mutáns sejtjeit a későbbi logaritmikus növekedési fázisban 0,5 mg/ml töménységben N-metil-N1 -nitro-N-nitrozoguanidinnal kezeltük 30 percig 30°C-on, és ezután 0® menynyiségben csészében levő olyan agar-táptalajra vittük, amely O-metil-treonint, az Gizoleucin egy analógját 5 mg/ml töménységben tartalmazta. 5 napos tárolás után az analóg gátló hatásával szemben ellenálló mutánsokat kiválasztottuk és megvizsgáltuk L-izoleucin-termelő képességüket. A legjobb mutánsokat amelyek körülbelül 10 g/liter Gizoleucint termeltek, kiválasztottuk, és N-metil-N1-nitro-N-nitrozoguanidinnal való kezelés után a fent leírt módon 10 mg/ml O-metil-treonint tartalmazó agar-táptalajra vittük. A rezisztens mutánsokat a fent leírt módon elkülönítettük és megvizsgáltuk L-izoleucin-termelő képességüket. A kapott törzset VNlIGenetika 10-89 törzsnek neveztük el, és a szelekciójában csak egy izoleucinanalógot használtuk fel. A törzs növekedéséhez nem szükséges aminosav, amennyiben a vad típusú Brevibacterium flavum-hoz hasonlóan a vitamin-(biotin, ti amin) szükségletét megtartja. A VNlIGenetika 10-89 törzset a VNlIGenetika intézet ipari mikroorganizmusokat őrző központi tárában CMPM B-1507 szám alatt letétbe helyeztük. Az O-metil-treoninnal szemben mutatott ellenállóképességét kivéve, a VNlIGenetika 10—89 törzs tenyészetének morfológiai jellemzői megegyeznek a vad típusú Brevibacterium flavum törzs jellemzőivel. A találmány szerinti eljárás további megvilágítására az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi kiviteli példákat arjuk meg 1. példa A Brevibacterium flavum VNlIGenetika 10-89 törzs tenyészetét 24-36 óra hosszat 30 °C hőmérsékleten húspepton-tartalmú ferde agaron tenyésztjük. Ezután oltókaccsal 750 ml térfogatú lombikokba, amelyek egyenként 100 ml táptalajt tartalmaznak, átoltjuk Táptalajként hús-pepton-boution keverékét alkalmazzuk, amelyet beoltás előtt sterilizálunk. Sterilizálás után a lombikokat 220—240 egység/perc sebességű rázóasztalra helyezzük, és a tenyészetet 20—24 órán keresztül 30°C-on tarjuk. Az így elkészített tenyészetből 750 ml térfogatú lombikokban levő 25 ml tápoldathoz 3—5 térfoga1%-nyi mennyiséget adunk. A tápoldat összetétele a következő: glükóz 130,0 g/liter ammónium-szulfát 30,0 g/liter kálium-dihidrogénfoszfát 1,5 g/liter magnézium-szulfát 0,5 g/liter kálcium-karbonát 40,0 g/liter biotin 200 pg/liter tiamin 300 pg/liter csapvíz ad 1 liter A tápoldat valamennyi komponensét 0,5 atmoszférán 30 percig sterilizáljuk. Az oldat pH-értékét a sterilizálás után kénsavval 7,0—7,2-re állítjuk be. A tenyésztést levegőztetés mellett 30 °Gon 72 óra hosszat végezzük Ekkor a tenyészetben az Gizoleucin koncentrációja 17 g/liter. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
