178052. lajstromszámú szabadalom • Fermentációs eljárás egy új antibiotikum, a tienamicin előállítására
178052 glükóz I. Táblázat + maltóz ± arabinóz — mannit ± cellulóz — mannóz ± fruktóz ± raffinóz — inozit — ramnóz — laktóz — szacharóz ± xilóz ± A mikroorganizmus növekedésének mértéke a következőképpen változik a hőmérséklet-, az oxigén-szükséglet és a nitrát hatásának a változásával: Hőmérséklet határok (élesztő-extráktum-glükóz + sók agar): 15 28 °C - jó 37 °C — közepes 50 °C — nincs növekedés Oxigén-szükséglet („Stab’’-tenyészet élesztő-ext- 20 raktum-glükóz + sók agarban): aerob nitrát-redukció — pozitív. A találmány szerinti új antibiotikumot, a tienamicint, valamely szokásos vizes tápközegben, szabályozott reakciókörülmények között végzett aerob 25 fermentációval, a Streptomyces cattleya mikroorganizmussal történt beoltás útján állítjuk elő. Vizes tápközegként alkalmazhatunk bármely olyan tápközeget, amelyet más antibiotikum tenyésztéséná használnak. Ez a tápközeg tartalmaz szén-, 30 nitrogén- és szervetlen só-forrásokat, amelyeket a mikroorganizmus asszimilálni képes. Szénhidrátokként általában például cukrokat, mint glükózt, fruktózt, szaccharózt, xilózt, mannitot és hasonlókat használunk, valamint keményítő- 35 két, és gabona-féléket, példáu zabot, rozst, kukorica-lekvárt és hasonlókat alkalmazhatunk önmagukban vagy kombinálva a tápközeg asszimilálható szén-forrásaként. A felhasznált szénhidrát-forrás vagy -források pontos mennyisége a tápközegben 40 részben függ a tápközeg többi alkotórészeitől, de általában a szénhidrát-mennyiség a tápközegben 1—6% szokott lenni. Az említett szén-forrásokat használhatjuk önmagukban, de kombinálhatjuk is őket a tápközegben. 45 Általában számos proteines anyagot alkalmazhatunk a fermentációs eljárás nitrogén-forrásaként. Alkalmas nitrogén-fonások például az éleszt ő-hidrolizátumok, primer élesztő, szójabab-liszt, gyapotmag-liszt, kazein-hidrolizátumok, kukorica-lekvár, 50 desztillálási maradékok vagy paradicsom-pép és hasonlók. Az említett nitrogén-fonásokat alkalmazhatjuk önmagukban vagy egymással kombinálva, 0,2—6 sűly%-ban, a vizes tápközegre számítva. A tápközegben alkalmazható szervetlen sók, me- 55 lyek beépülnek a tenyésztőközegbe például azok, amelyek a következő ionokat szolgáltatják: nátrium-, kálium-, ammonium-, kalcium-, foszfát-, szulfát-, klorid-, karbonát- és hasonló ionokat. A felsorolásba beleértendők a kobalt-, mangán-, vas- és 60 magnézium-nyomok is. Megjegyezzük, hogy a fentiekben ismertetett tápközegek csak annak illusztrálására szolgálnak, hogy milyen széles variációjú az alkalmazható tápközeg, és nem jelentenek semmiféle korlátozást. 65 A fermentációt 20-37 °C közötti hőmérsékleten végezzük. Optimális eredmények elérése céljából azonban fermentációs hőmérsékletként 22—30°C-t alkalmazunk. A tápközeg pH-ja, amelyben a Streptomyces cattleya megfelelően tenyészthető, és így tienamicin keletkezik, 6,0-8,0 lehet. Az új antibiotikum, a tienamicin ugyan előállítható mind felületi, mind pedig süllyesztett tenyésztéssel, a fermentációt előnyösen a süllyesztett módszerrel végezzük. Az új antibiotikum előállítását laboratóriumi méretű fermentáció segítségével úgy végezzük, hogy a megfelelő tápközeget beoltjuk az antibiotikumot képző tenyészettel, majd áthelyezzük úgynevezett előállítási tápközegbe, és a fermentációt mintegy 24 °C-on, a hőmérsékletet állandó értéken tartva, néhány napig rázógépben végezzük. A fermentációt sterilizát lombikban indítjuk be, a tápközegben egy- vagy több lépésben előállítva az oltási tenyészetet. Az erre alkalmazható tápközeg bármely megfelelő szén- és nitrogén-forrás-kombináció lehet. Az oltási tenyészetet tartalmazó lombikot állandó hőmérsékletű helyiségben, mintegy 28 °C-on 2 napig rázzuk, illetve addig, ameddig megfelelő a tenyészet-növekedés, és a kapott tenyészetet vagy arra használjuk, hogy beoltsuk vele a második fázisú oltási tenyészetet, vagy az úgynevezett előállítási tápközeget. Ha közbenső úgynevezett oltási tenyészetet tartalmazó lombikokat használunk, úgy ezekben a tenyészetet lényegében azonos módon tenyésztjük tovább, vagyis az utolsó oltási tenyészetet tartalmazó lombik tartalmának egy részét alkalmazzuk az előállítási tápközeg beoltására. A beoltott tenyészetet tartalmazó lombikokat állandó hőmérsékleten néhány napig keveijük, és az inkubációs periódus befejeztével a lombik tartalmát centrifugáljuk vagy szűrjük. Ha nagyipari méretekben végezzük a tenyésztést, úgy a fermentációt előnyösen valamely megfelelő, keverővei és a tápközeg levegőztető berendezéssel ellátott tartályban végezzük. Ennél a módszernél a tápközeget a tartályban készítjük el, és mintegy 120 °C hőmérsékletig hevítve sterilizáljuk. Hűtés után a sterilizált tápközeget beoltjuk az előzetesen elkészített úgynevezett inokulum tenyészet egy részével, és a fermentációt keverés és/vagy levegőztetés közben egy ideig, például 3-5 napig folytatjuk, miközben a hőmérsékletet állandóan mintegy 24°C-on tartjuk. Ezt a módszert különösen nagy mennyiségű tienamicin antibiotikum előállítására alkalmazhatjuk. A tienamicin fizikai és kémiai tulajdonságai: A tienamicin fehér, szilárd anyag, amely vízben igen jól, metanolban csak korlátozottan oldható. Foszfát-puffer-oldatokban mért molekulasúly mintegy 282 Dalton, a mérést analitikai ultracentrifugálássá végezve, rövid oszlop ülepedési módszert alkalmazva, aholis az ülepedett anyag abszorpcióját 30Ö nm-es abszorpciós optikai úton határoztuk meg, A tömegspektrogram 272-es molekulasúlyt jelzett. Az antibiotikumnak a kombinált molekulasúlya az elektronmikroszkóp letapogató fény-nya3
