177805. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nem kötörr hormonok vagy gyógyszerek meghatározására
5 177805 6 zadása, valamint a szabad és fehérjéhez kötött hormonok szétválnak. Ez a duzzadási fázis körülbelül 1 percig tart. A következő lépésben mindkét pumpát működtetjük. Az 1 pumpa eluáló folyadékot, például puffer-oldatot vagy vizet, a 2 pumpa jelzett hormont tartalmazó eluáló oldatot visz az oszlopra. Lehetséges olyan variáció, hogy csak a 2 pumpa működik (előre menetben), ekkor a fehérjék eluálásával egyidőben történik a jelzett hormon felvitele. Annak érdekében, hogy a jelzett oldat a gélbe való jutás előtt ne keveredjen össze a puffer oldattal, azaz ne híguljon, a puffer-oldatot és a jelzett oldatot külön csatornákon vezetjük a gél fölé. Az elúciót és a jelzett oldat felvitelét a lehető leggyorsabban végezzük, hogy ne legyen ideje a hormonnak a gélből kidiffundálnia. A meghatározás kívánt pontosságát úgy érjük el, ha vagy pontosan ismert mennyiségben visszük fel a jelzett hormont, vagy az antitest telítési tartományában dolgozunk. Ezután újabb szünetet tartunk, ami alatt a jelzett hormon a még szabad immobilizált antitestekkel reagál. Ennek időtartama körülbelül 10 perc. Ezután tiszta puffer-oldattal eluálunk úgy, hogy az 1 pumpa előre megy. Ennek az elúciónak a következtében szétválnak az antitesthez kötött és nem kötött jelzett hormonok. A meghatározandó anyag koncentrációjának mércéje az eluátumban mérhető, illetve az oszlopon maradt radioaktivitás. A hormont különböző koncentrációban, de ismert mennyiségben tartalmazó, fehérje-mentes oldatokkal kalibrációs görbét készítünk. A dialízissel és szenes adszorpcióval végzett, ismert meghatározás eredményeit összehasonlítva a találmány szerinti eljárás eredményeivel azt találtuk, hogy valóban csak a szabad, diffuzibilis hormon mennyiségét mértük. A rajzon ábrázolt berendezés több csatornás, párhuzamosan több minta meghatározására alkalmas. A gyakorlati tapasztalat azt mutatta, hogy a disszociáció csökkentése érdekében nem szükséges a hőmérsékletet 0 °C-on tartani, sokkal kedvezőbb 22 °C-on dolgozni. A találmányt részletesebben a következő példák segítségével világítjuk meg. 1 .példa Szérumban levő diffuzibilis kortizol meghatározása A polimer gélbe zárt immobilizált antitestet a következőképpen állítottuk elő. Minden tételhez úgy állítottuk be a koncentrációt, hogy a teljes monomer koncentráció 3,13 mól/liter legyen. Egy tételhez például 5 gramm akrilamidot, 1,25 gramm N,N'-metilén-bisz-akrilamidot főzőpohárban, 24 ml 7,2 pH-értékű foszfát-pufferban oldottunk fel. Kopolimer előállításánál az akrilamidot ekvimoláris mennyiségű akril-származékkal helyettesítettük. Az antiszérumnak 1 ml foszfát-pufferban való hozzáadása után a reakciót 0,15 mg riboflavin és 0,10 ml N,N,N’,N’-tetrametil-etilén-diamin hozzáadásával és ultraibolya besugárzással indítottuk be. A 45 perces besugárzási idő alatt a hőmérsékletet 50 °C alatt tartottuk. A keletkezett gélmasszát aprítottuk, majd desztillált vízzel mostuk és szárítottuk. A diffuzibilis kortizol meghatározásánál két dugattyús pumpát alkalmaztunk, az egyiket (1) 0,68 ml/perc, a másikat 0,5 ml/perc (2) sebességgel működtettük. A pumpák két irányban, előre- és hátramenetben képesek működni. Az antikortizolantitestet tartalmazó száraz gélből 60 mg-ot töltöttünk a szűrővel ellátott oszlopokba. A reakcióedényből 320 jxl olyan inkubációs oldatot szívtunk a pumpák segítségével az oszlopokra, amely 7,2 pH-értékű foszfát-pufferban a következő oldott anyagokat tartalmazta: a kalibrációs görbe készítéséhez nem jelzett kortizolt növekvő koncentrációban (0,56 és 17,66 pMol között), szérum-meghatározáshoz hígított szérumot (1: 12). A reakcióhőmérsékletet 0 C +0,5 °C értékben tartottuk. 4 perc duzzadási idő után 630 [xl 1 * 3H-kortizol-oldattaI eluáltuk a fehérjét az oszlopokról és az eluátumot szcintillációs üvegekbe gyűjtöttük. 10 perc inkubációs idő után a 2 pumpával felvitt 7,2 pH-értékű foszfát-pufferral eluáltuk a szabad, antitesthez nem kötött 3H-kortizolt és így elválasztottuk az antitesthez kötött 3H-kortizoltól. A 3 perces elúciós idő alatt kapott 1 ml eluátumot szcintillációs üvegben fogtuk fel, 15 ml szcintillációs oldattal kiegészítettük és folyadékszcintillátorban mértük a radioaktivitását. A percenkénti impulzusból (cpm) számítottuk a szabad 3H-kortizol indikátor-haptén koncentrációját. A kalibrációs görbe alapján megállapítottuk a szérumban levő szabad, diffuzibilis kortizol mennyiségét. A következő akril-származékokat tartalmazó antitest-mátrixokat próbáltuk ki: 100% akrilamid; 60% akrilamid és 40% metakrilsav-észter; 60% akrilamid és 40% metakrilsav. A monomer koncentrációja mindegyik esetben 3,13 mól/liter volt, és így körülbelül 0,8—■ 1,0 nm-es pórusnagyságot értünk el. A gélszemcsék mérete átlagosan 400 fim volt. 0,5 ml/perc elúciós sebességgel 4 perc alatt a szabad haptén 92%-át sikerült eluálni. A diffuzibilis kortizol mennyiségére különböző feltételek mellett méréseink alapján a következő értékeket kaptuk ji.g/100 ml-ben: normál körülmények között 1,5 és 2,5 között; ACTH-stimulációs tesztnél 4,5 és 10,8 között; dexamethason-szupressziónál 0,15 és 1,0 között ; terhességnél 3,0 és 7,8 között. Ezek az eredmények egyeznek a hagyományos módszerekkel, például egyensúlyi dialízissel kapott eredményekkel. 2. példa Tesztoszteron meghatározása A munkamenet lényegében megegyezett a kortizol meghatározásánál leírtakkal. Az antitest tartalmú gélből 160 mg-ot alkalmaztunk, az oszlopokra 1 ml inkubációs oldatot vittünk fel és a fehérje eluációját 1580 ;a.l 100 ul-enként 270 pg 3H-tesztoszteront tartalmazó oldattal végeztük. A formális szenzitivitás 10 pg/ml volt. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás nem kötött hormonok és gyógyszerek, előnyösen pajzsmirigy-hormonok, szteroid-hormonok, szívglikozidok, véralvadásgátlók, fájdalomcsillapítók, szalicilátok és triciklusos antidepresszivumok mennyiségé-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
