177739. lajstromszámú szabadalom • Eljárás beágyazott - kémiai reakciók befolyásolására alkalmas - aktív anyagot, főleg enzimeket tartalmazó porózus szerkezetű szálak előállítására
5 177739 6 4. példa Cellulóztriacetát alapú, porózus szerkezetű szálak használata hordozóként protein kémiai immobilizálására A következő három száltípust vizsgáljuk: A) Az 1. példában leírt módon szálhúzással kapott porózus szerkezetű szálak. 50 g cellulóztriacetátot feloldunk 664 g metilénkloridban és 200 g glicerolt alkalmazunk diszperz-fázisként, 500 végtelen szálat képezünk, amelyek mindegyike 3,7 denier finomságú. B) Az A) pontban megadott körülmények között előállított porózus szerkezetű szálak, de diszperz-fázisként 100 g glicerollal. Ugyancsak 500 végtelen szálat képezünk, amelyek 3—7 denier finomságúak. C) Nem porózus szerkezetű szálak, amelyeket az A) és B) pontban megadott körülmények között állítunk elő, de diszperzfázis nélkül. Szintén 500 végtelen szálat képezünk, amelyek finomsága 3,9 denier. A denier a fonal finomsági számát jelöli, amelyet 10 mérés átlagszámaként kapunk : 500 végtelen szálat tartalmazó mintából vett 100 cm hosszúságú anyagot egymás után ötször desztillált vízzel mosunk, mindegyik mosáshoz 50 ml vizet használunk. Az egyes mosásoknál az érintkezési idő 10 perc szobahőmérsékleten, keverés közben. A mintát mosás után 70 °C-on és 0,1 Hgmm nyomáson 8 óra hosszat szárítókamrában szárítjuk, utána megmérjük. Az így kapott száraz súlyból minden egyes végtelen szál finomságát a következők szerint számítjuk: szárazsúly (g) 9000 : 500 aránynál. Minden egyes szálból egy-egy mintát kezelünk, úgy, hogy azonos mennyiségeket tartalmazzon; például 1,78 g cellulóztriacetátot, és pontosan 9,89 g A) szálat, 5,78 g B) szálat és 1,85 g C) szálat. Mindegyik mintát egy-egy 300 ml-es Erlenmeyer-lombikba tesszük és ötször mossuk, minden egyes mosást 200—200 ml desztillált vízzel végzünk. Ezt követően a mintákat 4 óra hosszat, keverés közben, szobahőmérsékleten, 0,5 mólos vizes nátriumhidroxid'•oldattal kezeljük. Ilyen kezelés után az eredeti polimer cellulózzá alakul és így legalább részben megmarad a szál eredeti szerkezete, amely a később megadott eredményekből is látható. Minden egyes mintát nátriumkarbonáttal hidrolizálunk, vízzel semlegesre mosunk és keverés közben szobahőmérsékleten 20 óra hosszat 165 ml 0,05 mólos 8,0 pH-jú vizes foszfát-pufferrel, amely 0,285 g benzokinont tartalmaz, kezelünk (ez a ezelés aktiválja a szálat és alkalmassá teszi arra, hogy kémiailag megkösse a proteint [lásd 175 295 sz. magyar szabadalmi leírás]). Ilyen kezelés után az egyes mintákat egymás után v^el és 8,0 pH-jú 0,05 mólos foszfát-pufferrel mossuk, a dig, amíg a mosóvíz már nem tartalmaz olyan anyagot, amely 250 Hgmm-nél már nem abszorbeál, majd a mintát tripszininszolubilizációs tesztnek vetjük alá. Mmden egyes mintát 47 ml 0,05 mólos 8,0-es pH-jú és -ra hűtött foszfát-pufferrel érintkeztetünk, amely mg olyan tripszint tartalmaz, amelynek a fajlagos *vitása 30 BAEE egység/mg (egy enzimes BAEE dsyseg az az enzimmennyiség, amely percenként egy U...N-alfa-benzoil-L-arginin-metilésztert hidro- L, ’ P^"n és 25 °C-on). A reakciót 24 óra hosszat után , ^oz*!>en ? °C-on végezzük. A reakció lejátszódása a három mintát egymást követően vízzel és 0,05 mólos 8,0-es pH-jú foszfátpufferrel mossuk mindaddig, ameddig enzimaktivitás már nem mutatható ki. A protein-inszolubilizációs reakció befejeződése után mérjük a reakcióoldat maradék enzimaktivitását, amely az egyes száltípusoknál a következő: A) mintát érintő oldat 7,9 BAEE egység/ml, B) mintát érintő oldat 13,1 BAEE egység/ml, C) mintát érintő oldat 25,2 BAEE egység/ml. Az enzimaktivitás mérésénél a következő eredményeket kapjuk: A) szál 650 BAEE egység/g száraz termék, B) szál 450 BAEE egység/g száraz termék, C) szál 80 BAEE egység/g száraz termék. 5. példa Cellulóztriacetát alapú, porózus szerkezetű szálak használata hordozóként, protein kémiai immobilizálására 4,94 g, előző példában említett A) szálat vízzel mosunk, utána 100 ml 0,5 mólos nátriumhidroxid-oldattal hidrolizálunk és ezt követően benzokinonnal aktiválunk. Az aktiváláshoz 83 ml 0,05 mólos, 8,0 pH-jú foszfátpuífert és 0,142 g benzokinont tartalmazó oldatot használunk, végül vízzel mossuk az anyagot. Az előző példában megadott módon járunk el, a kapott terméket a penicillin-aciláz enzimmel reagáltatjuk a következő körülmények között: a mintát lassú keverés közben 24 óra hosszat szobahőmérsékleten 25 ml 0,04 mólos, 7,6 pH-jú foszfát-pufferrel érintkeztetjük, amely 38 egység/ml penicillin-acilázt tartalmaz. Ez az Escherichia coli (ATCC—9637)-ból származik, amelynek a fajlagos aktivitása 5 egység/mg protein. (Egy enzim-egység az az enzimmennyiség, amely percenként 1 mikromól penicillin G-t 6-aminopenicillánsavvá és fenilecetsavvá alakít a következő körülmények között: hőmérséklet 37 °C, 0,01 mólos 8,0 pH-jú foszfát-puffer és 2 súly%-os penicillin G, össztérfogat 200 ml és összesen 15—30 enzimegység van jelen. Ilyen körülmények között az enzimreakció kezdeti sebességének a mértéke, mikromól/percben kifejezve, megegyezik magával az enzimegységgel). Végül meghatározzuk a szálon kötődő enzimaktivitást, amely még visszamarad azután, ha a mintát a reagálatlan enzim eltávolítása érdekében vízzel mossuk. Az aktivitás 444 mikromól/perc/1 g száraz termék. 6. példa Poli-L-gamma-metilglutamát, pórusos szerkezetű szálak használata hordozóként protein kémiai immobilizálására 3,92 g poli-L-gamma-metilglutamát szálat, amelyet a 2. példában leírt módon állítunk elő, négyszer mosunk 50—50 ml desztillált vízzel, a glicerol eltávolítása végett, utána pedig ötször mossuk 50—50 ml vízmentes metanollal, a víz eltávolítása végett, végül pedig 50 ml vízmentes metanolban, amely 2,0 millimól hidrazinhidrátot tartalmaz, feliszapoljuk. Az elegyet lassan szobahőmérsékleten keverjük. A reakciót títrálással ellenőrizzük, ennek során megállapítjuk a hidrazin eltűnését a reakcióoldatból. Miután 0,98 millimól hidrazin fogyott el a reakcióoldatból, a reakciót megszakítjuk, úgy, hogy az oldatot metanolba szűrjük és a szálasanyagot három-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
