177134. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 1-helyzetben alfa-hidroxisavat tartalmazó angiotenzin-II antagonista hatású angiotenzin-II analogok előállítására
7 177134 8 2. Táblázat Az l-es helyzetben a-hidroxisavat tartalmazó angiotenzin-II analógok hatása a vérnyomásra angiotenzin infúzió alatt s.c. alkalmazáskor Dózis Analógok úg/kg Oldószer s. c. Vérnyomáscsökkenés (Hgmm) 15 30 60 120 perc múlva (L-a-hidroxipropionil, Leu8)-Ang-II (L-a-hidroxi-propionil, Iles)-Ang-II 200 fiz. SÓ + + CMC-28 ±3,1-38 ±2,4-25 ± 1,5-5 ±1,8 200 zselatin-28 ± 10,0-28 ±7,0-25 ± 6,0-5 ± 7,3 A végtermék tisztítása: 0,5 g szabad pepiidet 4 ml 0,01 n ammóniumacetát pufferben feloldunk, majd az oldatot 0,5 liter karboximetilcellulóz (CMC 52) oszlopra rétegezzük, amelyet előzőleg a fenti pufferrel egyensúlyba hoztunk. Gradiens keverővei 20 1,5 liter, 0,01 mólos 1,5 liter 0,4 mólos ammóniumacetát-oldatokat összekeverve gradiens elúciót alkalmazunk. Az áramlási sebesség 25 ml/óra és 10 ml-es frakciókat szedünk. Az oszlopról lejövő eluátumot LKB Uvicord—II készülék (az LKB Produkter A. 25 B. svéd cég gyártmánya) segítségével folyamatosan regisztráljuk, majd a kapott görbe alapján a kívánt terméket tartalmazó frakciót Leybold—Heraeus Jioftlizáló készüléken (Leybold—Heraeus Inc., USA, gyártmánya) liofílizáljuk. A liofilizátum kis mintá- 30 ját a tisztaság ellenőrzése céljából ugyancsak gradiens elúció segítségével újra kromatografáljuk 20 ml-es analitikai oszlopon. 1. példa (Hidroxiacetil1 ,Leu8 )-angiotenzin-II előállítása Boc—Arg(NOz)—Val—Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)—-Pro—Leu-ONB 45 4,2 g (12 mmól) Leu-ONB • HBr 50 ml kloroformos oldatához hozzáadunk 1,68 ml trietilamint és 3,81 g (10 mmól) Boc—Pro—OPFP-t. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 20 percig keverjük, majd 30 ml vízzel és 30 ml 10%-os vizes citromsav- 50 oldattal kirázzuk, szárítjuk és a kloroformos oldatot bepároljuk. A védett dipeptidet (R) =0,8) izolálás nélkül feloldjuk 20 ml 8 n sósavas dioxánban, 10 perc múlva 60 ml száraz éterrel hígítjuk, majd bepároljuk. A szabad dipeptid-klórhidrátot 55 (R? = 0,56) 50 ml kloroformban feloldjuk, az oldat pH-ját trietilaminnal 8-ra állítjuk és hozzáadunk 8,8 g (15 mmól) Boc-His(Dnp)-OPFP-t. Az oldatot 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük úgy, hogy az oldat pH-ját állandóan 8-on tartjuk. Ez- 60 után az oldathoz 1,65 ml N ,N -dimetilaminoetilamint adunk a fölös aktivészter eltávolítása céljából, majd 10 perc múlv a reakcióelegyet 25—25 ml 10%-os vizes citromsav-oldattal, n sósavval és 5%-os nátriumhidrogénkarbonát-oldattal ki- 65 rázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás után az oldatot bepároljuk. A maradék védett tripeptidet (Rf =0,65) izolálás nélkül feloldjuk 25 ml 8 n sósavas dioxánban és 15 perc múlva a szabad tripeptidet R£ = 0,47) 100 ml száraz éter hozzáadásával kicsapjuk, szüljük. Azonnal feloldjuk 50 ml kloroform és 20 ml dimetilformamid elegyében, trietilamin hozzáadásával a pH-t 8-ra állítjuk, és hozzáadunk 6,0 g (15 mmól) Boc—Ile—OPFP-t, 30 perc múlva a reakcióelegyet szárazra pároljuk, a maradékot feloldjuk 100 ml etilacetátban, és 30-30 ml vizes citromsav-oldattal, n sósavval és vízzel extraháljuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás után az etilacetátot bepárlással eltávolítjuk, és a maradékot 100 ml éter : n-hexán =1:9 elegyével eldörzsöljük és a védett tetrapeptidet (Rf =0,64) szűréssel izoláljuk. Ezután feloldjuk 25 ml 8 n sósavas dioxánban, és 15 perc múlva a szabad tetrapeptidet (Rj =0,40) 120 ml száraz éterrel kicsapjuk és szűqük. A tetrapeptid-klórhidrátot 50 ml kloroform és 30 ml dimetil-formamid elegyében feloldjuk, trietilaminnal az oldat pH-ját 8-ra állítjuk, és hozzáadunk 6,0 g (11,5 mmól) Boc-Tyr(Bzl)-OPFP-t. 15 perc múlva az oldatot bepároljuk, a maradékot 100 ml etilacetátban feloldjuk és hozzáadunk 0,66 ml N,N-dimetilaminoetilamint. 10 perc múlva az etilacetátos oldatot 30—30 ml 10%-os vizes citromsav-oldattal, n sósavval és vízzel kirázzuk, vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás és bepárlás után a maradékot 70 ml száraz éterrel eldörzsöljük és a védett pentapeptidet (Rf = 0,8) szűréssel izoláljuk. Ezután feloldjuk 25 ml 8 n sósavas dioxánban, és 15 perc múlva a szabad pentapeptidet (Rf = 0,8) 100 ml száraz éterrel kicsapjuk, szüljük és 30—30 ml éterrel kétszer mossuk. Azonnal feloldjuk 50 ml dimetilformamidban, a pH-t trietilaminnal 8-ra állítjuk, és hozzáadunk 4,2 g (11 mmól) Boc—Val—OPFP-t. Egy órai szobahőmérsékleten történő keverés után az oldatot bepároljuk, a maradékot feloldjuk 100 ml kloroformban, majd 30—30 ml 10%-os vizes citromsav-oldattal, n sósavval és vízzel kirázzuk. Vízmentes nátriumszulfáttal történő szárítás után az oldatot bepároljuk és a maradékot 100 ml éterrel eldörzsöljük és a védett hexapeptidet szűréssel izoláljuk (Rf = 0,82). A védett hexapeptidet 25 ml 8 n sósavas dioxánban feloldjuk és 15 perc múlva a szabad hexapeptidet (R8 =0,55) 120 ml száraz éterrel kicsapjuk, szűrjük és 30—30 ml éterrel kétszer mossuk. Azonnal feloldjuk 50 ml dimetilformamidban, trietilaminnal a 4
