177070. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a BM.123 gamma antibiotikum, alkilezett származékainak előállítására
21 177070 22 hidroxiddal pH = 7,0 értékre semlegesítjük, majd 5% diatómaföldön szüljük. A szűrőlepényt körülbelül 100 liter vízzel mossuk. A szűrletet egyesítjük a mosófolyadékkal, és az így kapott folyadékot alulról felfelé áramoltatva három, egyenként 5 15 liter nátrium-formájú CM Sephadex C-25 gyantával (térhálós dextrán-ep'iklór-hidrin-gyanta, gyártja a Pharmacia Fine Chemicals, Inc.) töltött, 31 x 122 cm méretű saválló acél-oszlopon bocsátjuk át. A gyantaoszlopokat összesen körülbelül 390 li- 10 ter vízzel mossuk, majd 200 liter 1%-os, vizes nátriumklorid-oldattal, végül 560 liter 5%-os, vizes nátriumklorid-oldattal eluáljuk. Az utóbbi eluálószer felhasználásával kapott eluátumot diatómaföldön szüljük, és a szűrletet 25 liter szemcsés Darco 15 G—60-nal (20—40 mesh szémcseméretű aktív szén, az Atlas Chemical Industries Inc. cég gyártmánya) töltött, 23 x 152,4 cm méretű üvegoszlopon bocsátjuk át. Az oszlopot 120 liter vízzel mossuk, majd 120 liter 15%-os, vizes metanollal, 20 340 liter 50%-os, vizes metanollal, végül 120 liter 50%-os, vizes acetonnal eluáljuk. A 15%-os, vizes metanol felhasználásával kapott eluátumot vákuumban körülbelül 7 liter végtérfogatra bepároljuk, és a kapott vizes maradékot (pH = 4,5) hidroxil-formájú 25 Amberlite IR-45 gyantával (gyengén bázikus, polisztirol-poliamin típusú anioncserélő gyanta) kezelve pH = 6,0 értékre semlegesítjük. A gyantát kiszűqük, a szürletet vákuumban körülbelül. 1 liter végtérfogatra bepároljuk, majd a kapott koncentrá- 30 tumot fagyasztva szárítjuk. 38 g terméket kapunk, amely csekély mennyiségű BM123y antibiotikum (főtömegében B 12372 antibiotikum) mellett elsősorban BM123j3 antibiotikumot tartalmaz. Az 50%-os, vizes metanol felhasználásával kapott 35 eluátumot (pH = 4,5) Amberlite IR-45 gyantával kezelve pH = 6,0 értékre semlegesítjük. A gyantát kiszűqük, és a szűrletet vákuumban körülbelül 6,3 liter végtérfogatra bepároljuk. A koncentrátumot fagyasztva szárítjuk. 213 g terméket kapunk, 40 amely fő tömegében BM1237 antibiotikumból áll. Az 50%-os, vizes aceton felhasználásával kapott eluátumot (pH = 4,0) Amberlite IR-45 gyantával kezelve pH = 6,0 értékre semlegesítjük. A gyantát kiszűijük, a szűrletet vákuumban körülbelül 1,5 45 liter végtérfogatra bepároljuk, és a koncentrátumot fagyasztva szárítjuk. 56 g szennyezett BM1237 antibiotikumot kapunk. 4. példa 50 A BM1237 antibiotikum tisztítása 2,6 cm átmérőjű üvegoszlopot körülbelül 62 cm magasságig ammónium-formájú CM Sephadex C—25 55 gyanta 2%-os, vizes ammóniumklorid-oldattal készített szuszpenziójával töltünk fel. A 2%-os, vizes ammóniumklorid-oldat fölöslegét lecsurgatjuk, majd az oszlopra 5,0 g, a 3. példában ismertetett módon előállított BM123y antibiotikum körülbelül 60 10 ml 2%-os, vizes ammóniumklorid-oldattal készített oldatát visszük fel. Az oszlopot 6 liter 2%-os, vizes ammóniumklorid-oldat és 6 liter 4%-os, vizes ammóniumklorid-oldat felhasználásával, grádiens-elucióval eluáljuk, és az effluenst 75 ml-es 65 frakciókba gyűjtjük. A frakciókat 15 percenként fogjuk fel. Az egyes eluátumfrakciókat ultraibolya spektroszkópiával és bioautográfíás úton (Klebsiella pneumoniae AD törzzsel beoltott, nagy agarlemezekre helyezett, a vizsgálandó eluátumfrakcióval átitatott szűrőpapirkorongok felhasználásával) vizsgáljuk. E vizsgálatok szerint a BM1237 antibiotikum fő tömege a 71-107. frakcióban található. 130 ml, 20-40 mesh szemcseméretű Darco G—60-at vízben szuszpendálunk, a szuszpenziót üvegoszlopba töltjük, a szénszemcséket ülepedni hagyjuk, majd a víz fölöslegét lecsurgatjuk.. Az előző kromatográfiás műveletben kapott 84-96. frakciót egyesítjük és átbocsátjuk a szénoszlopon. Az oszlopot 600 ml vízzel mossuk, majd 1 liter 50%-os, vizes acetonnal eluáljuk. Az eluátumokat, amelyek BM1237 antibiotikumot tartalmaznak, vákuumban betöményítjük, majd a kapott vizes koncentrátumot fagyasztva szárítjuk. 886 mg BM123y antibiotikumot kapunk hidroklorid-só formájában. A fenti tisztítási művelet megismétlésével kapott mintát mikroelemzésnek vetjük alá. A BM1237 antibiotikum nem rendelkezik határozott olvadásponttal, hanem körülbelül 200 °C-tól kezdve fokozatosan bomlásnak indul. A 24 órán át 22 °C-os, 23% relatív páratartalmú térben tartott minta elemzési adatai a következők: C: 39,44%, H: 6,10%, N: 16,19%, Cl (ionos): 11,54%, szárítási veszteség: 8,19%. A BM123y antibiotikum vizes közegben felvett ultraibolya abszorpciós spektrumában 286 nm-nél észlelhető maximum (EJ%m=250). A maximum helye a közeg pH-jának változtatásával nem változik. A BMI23y antibiotikum optikai forgatóképessége: (a)p5 = + 71° (c = 0,97%, vízben). A BM123y antibiotikum káliumbromid-pasztillában felvett infravörös abszorpciós spektrumát az 1. ábrán mutatjuk be. A spektrumban a következő jellemző csúcsértékek észlelhetők: 770, 830, 870, 930, 980, 1035, 1105, 1175, 1225, 1300, 1340, 1370, 1460, 1510, 1555, 1605, 1660, 1740, 2950, és 3350 cm-1. 5. példa A BM 1237i antibiotikum elkülönítése 2,6 cm átmérőjű üvegoszlopot körülbelül 70 cm magasságig nátrium-formájú CM Sephadex C-25 gyanta 2%-os, vizes nátriumklorid-oldattal készített szuszpenziójával töltünk fel. A 2%-os, vizes nátriumklorid-oldat fölöslegét lecsurgatjuk, majd az oszlopra 4,11 g, a 3. példában ismertetett módon előllított BM1237! antibiotikumot és kisebb mennyiségű BM12372 antibiotikumot, valamint egyéb szennyezőanyagokat tartalmazó anyag körülbelül 10 ml 2%-os, vizes nátriumklorid-oldattal készített oldatát visszük fel. Az oszlopot 4 liter 2%-os, vizes nátriumklorid-oldat és 4 liter 4%-os, vizes nátriumklorid-oldat felhasználásával, grádiens-elúcióval eluáljuk, és az effluenst 75 ml-es frakciókba gyűjtjük. A frakciókat 15 percenként fogjuk fel. Az egyes eluátumfrakciókat ultraibolya 11
