176865. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szalmonellák gyorsdiagnosztikai kimutatására biológiai közegben, előnyösen élelmiszerekben
3 176865 4 szer esetén akár több gramm is lehet. Amennyiben szilárd anyag vizsgálatát végezzük, azt például kémcsőben, centrifugacsőben vagy üvegedényben vízzel, pufferoldattal, vagy valamely híg táptalajjal keverjük illetve szuszpendáljuk, majd kívánt esetben a folyadékot tisztítjuk, hogy ne tömje el a membránszűrőt. A tisztítás történhet ülepítéssel, centrifugálással, szűréssel, vagy bármely alkalmas módszerrel. Amennyiben a vizsgálat elvégzésére több idő áll rendelkezésre, a meghatározáshoz alkalmazhatjuk a vizsgálandó anyag 4 órás, steril boullionnal készített tenyészetét is. Az eljárás következő lépésében az előkészített folyadékot célszerűen 0,45 mikron porozitású membránszűrőn átszűrjük. Ezt a membránszűrőtípust alkalmazzák például E. coli kimutatására vízvizsgálatoknál. Mivel a későbbiek során célszerű, hogy a futtatás során a kiindulási zóna minél kisebb átmérőjű legyen, a szűrést célszerűen módosított Zsigmondy-féle szűrőkészülékkel végezzük. A módosítás lényege, hogy a készülék átlyuggatott betétjét, melyre a membránszűrő kerül, olyan betétre cseréljük ki, melynek a közepén, vagy adott esetben több helyén is, kis, célszerűen 1 cm átmérőjű területen belül több, például 5—7, egyenként 2—3 mm átmérőjű nyílása van. így elérhető, hogy szűréskor a baktériumok a fenti lyukaknak megfelelő helyen koncentrálódnak. Az átszűrhető folyadék mennyisége — a membránszűrő eltömődését figyelembevéve — függ a folyadékban levő baktériumok számától, illetve az egyéb lebegő anyag mennyiségétől. A szűrés célja elsősorban az, hogy megfelelő mennyiségű baktériumtömeget adjon, mely az inkubálás során egyértelmű vándorlási foltot biztosít. Abban az esetben azonban, ha a vizsgálandó oldat megfelelően tömény baktériumokra nézve, a szűrés akár el is hagyható. Ilyen eset például, ha a vizsgálandó mintát — mint azt az előbbiekben már említettük — előzőleg bouillonnai inkubáljuk. Ilyen esetekben a minta adott esetben közvetlenül is felvihető a táptalajos szűrőpapírra. A szűrés befejezése után a membránfiltert eltávolítjuk és a szívatásnak megfelelő helyen kivágjuk, előnyösen 1 cm átmérőjű korong alakra. A korongot a baktériumokat tartalmazó oldalával lefelé szűrőpapírra helyezzük, amelyet előzőleg valamely baktériumok tenyésztésére alkalmas táptalajjal itattunk át. Ilyen táptalaj előnyösen egy bouillon táptalaj. A fenti átitatott szűrőpapírt, mely előnyösen csík- vagy négyzetalakú, például a következőképpen állíthatjuk elő: Whatman No. 1 szűrőpapírt 2,5 x 2,5 cm méretre vágunk, tárgylemezre fektetjük és pipettából az alábbiakban megadott táptalajt csepegtetjük rá, úgy, hogy a papíregész felülete be legyen borítva. A vizsgálandó membránfilter-korongot a lemez közepére helyezzük. A táptalaj összetétele a következő volt : Húskivonat (Oxoid): 1% Bacto pepton (hidrolizátum): 2% Élesztőextraktum: 0,5% Nátriumklorid : 0,5% Dextróz: 0,2% Na2HP04: 0,2% Az anyagokat forralással feloldjuk, így a táptalaj pH-ja 7,2 lesz. Áramló gőzzel végzett 1 órán át sterilizálás után 0,005% 2,3,5-trifenil-tetrazoliumkloridot (TTC) adunk hozzá (0,1%-os oldatból 5 ml-t 100 ml táptalajra). A fenti táptalaj hűtőszekrényben hosszú ideig eltartható. E táptalaj nagy előnye, hogy utólagos festésre nincs is szükség, a baktériumok vándorlását a TTC közvetlenül kimutatja. Ezután a szűrőpapírt a tárgylemezzel együtt nedveskamrába helyezzük, előnyösen Petri-csészében, ahol a párát nedves papírvatta biztosítja. A kamra hőmérséklete célszerűen 37 °C és az inkubációt előnyösen 3,5—4 órán át végezzük. Ezután a szűrőpapírt a baktériumok fixálására 10 percen át kb. 80 °C hőmérsékleten tartjuk, majd a szűrőpapírt valamely önmagában ismert baktériumfestő szerrel festjük. Erre a célra például 0,3%-os alkoholos savanyú fukszinoldatot használunk, majd néhány percig 10%-os ecetsavval mossuk. Amennyiben a vizsgált mintákban szalmonella volt jelen, 1,5—2 cm átmérőjű kör jelenik meg. A vizsgálat során célszerű ismert szalmonellatörzzsel kontrollvizsgálatot is végezni. A találmány szerinti eljárás megvalósításához célszerűen olyan eszköz használható, mely a fentiekben leírt módosított Zsigmondy-féle szűrőkészülékből, a membránfilterből és a membránfilterhez csatlakoztatható kézi kezelésű pumpa-rendszerből áll. Baktériumok mozgásvizsgálata Schleicher-Schüll 20/b minőségű (más sima szűrőpapír is alkalmas a vizsgálathoz) szűrőpapír kb. 2x2 cm-es darabját tárgylemezen buillon táptalajjal átitatunk. A vizsgálandó baktérium szuszpenziójának egy kacsnyi mennyiségét a papírdarab közepére tesszük. Nedveskamrában a csillés baktériumok 37 °C-on 2 óra elmúltával vándorolni kezdenek. Három és fél—négy óra múltán a középponttól mintegy 1 cm távolságra jutnak, 5—6 óra elmúltával 2 cm távolságra. A megtett út arányos az idővel. A szalmonellák ettől eltérően már három és fél—négy óra múltán mintegy 1,5 cm-t tesznek meg minden irányban, mozgásuk tehát gyorsabb és más baktériumoknál meg nem figyelhető, jól látható gyűrű rajzolódik ki megfestésükkor, (lásd a mellékelt mintát). Ebből a körből a szalmonellák a 4—5. órában kívülre vándorolnak. Ez a csíknak megfelelő helyéről történt leoltással is bizonyítható, ugyanígy a csíknak hőrögzítés utáni megfestésével. Az említett gyűrűt más baktériumoknál nem lehet kimutatni, viszont valamennyi szalmonellánál jól látható, a S. typhi-t is beleértve, amikor a szűrőpapírra rávitt szalmonellák száma 105, 106 körül van. Szabadalmi igénypont Eljárás szalmonellák gyorsdiagnosztikai kimutatására biológiai közegben, célszerűen élelmiszerekben, melynek során a biológiai anyagban levő mikroorganizmusokat kitenyésztjük és előhívjuk, azzal jellemezve, hogy a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
