176811. lajstromszámú szabadalom • Eljárás heparin tisztítására
3 176811 4 Htjuk meg. A legtisztább (körülbelül 270 egység/mg fajlagos aktivitású) heparint akkor kapjuk, ha adszorbensként mátrixhoz kötött antitrombint használunk fel. A találmány szerinti eljárással tehát egyszerű, ipari méretekben is jól alkalmazható módon állíthatunk elő igen tiszta, a jelenleg alkalmazottnál lényegesen nagyobb fajlagos aktivitású heparin-készítményeket. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. A heparin fajlagos aktivitását Denson és Bonnar módszerével határoztuk meg [Brit. J. Haematol. 30, 139 (1975)]. 1. példa Heparin tisztítása mátrixhoz kötött antitrombin felhasználásával A tisztításhoz felhasznált adszorbenst a következőképpen állítjuk elő: A mátrix aktiválása 3 g brómciánt 30 ml desztillált vízben oldunk, és az oldathoz 50 ml ülepített agarózt [Sepharose 4B, a Pharmacia Fine Chemicals cég (Uppsala, Svédország) gyártmánya] adunk. Az elegyet jégfürdőn keverjük, majd 4 mól nátriumhidroxid beadagolásával a rendszer pH-ját 11,2-re növeljük és 10 percig ezen az értéken tartjuk. Ezután a gélt hideg desztillált vízzel és 0,2 mólos nátrium-hidrogénkarbonát-oldattal mossuk. A fehérje felvitele a mátrixra 200 mg, Miller—Andersson és munkatársai módszerével [Thromb. Rés, 5, 439—452 (1974)] tisztított antitrombint 50 ml 0,2 mólos nátrium-hidrogénkarbonát oldatban oldunk, és az oldatot (pH=9,0) a fentiek szerint aktíváit gélhez adjuk. A szuszpenziót éjszakán át szobahőmérsékleten enyhén keverjük, majd nagy ionerősségű pufferolda tokkal mossuk. A mosáshoz váltakozva használunk fel nagy és kis pH-értékű pufferoldatokat. Heparin tisztítása A fentiek szerint előállított, mátrixhoz kötött antitrombint oszlopba töltjük, és az oszlopot 0,05 mólos trisz-pufferoldat és 0,15 mólos nátriumklorid-oldat elegyével (pH=7,4) egyensúlyba hozzuk. 300 mg heparint (Vitrum; fajlagos aktivitás: 130 egység/mg) 20 ml, 0,05 mólos trisz-pufferoldat és 0,15 mólos nátriumklorid-oldat elegyében (pH=7,4) oldunk, és az oldatot keresztülszivattyúzzuk az oszlopon. Ezután a gélt a fentivel azonos összetételű pufferoldattal mossuk, majd a heparint 0,05 mólos trisz-pufferoldat és 1,0 mólos nátriumklorid-oldat elegyével (pH=7,4) leoldjuk. Az eluátumból desztillált víz jelenlétében végzett gélszűréssel eltávolítjuk a sót (a gélszűréshez Sephadex G—25 gyantaoszlopot használunk fel; gyártja a Pharmacia cég), majd az eluátumot fagyasztva szárítjuk. 270 egység/mg fajlagos aktivitású, tisztított heparint kapunk. A molekulasúlyeloszlás vizsgálata során megállapítottuk, hogy a tisztított termékben jelenlevő anyagok molekulasúlya lényegesen szűkebb határok között változik, mint a kiindulási anyag esetén, A szénhidrát-elemzést karbazol-kénsavas módszerrel végeztük. 2. példa Heparin tisztítása mátrixhoz kötött antitrombin felhasználásával (szakaszos eljárás) A mátrixhoz kötött antitrombint az 1. példában ismertetett módon állítjuk elő. 300 ml így előállított, ülepített adszorbenst 0,05 mólos trisz-pufferoldat és 0,15 mólos nátriumklorid-oldat elegyével (pH=7,4) egyensúlyba hozunk, majd vákuumban leszűrjük és szár jutjuk. A kapott adszorbenst 500 mg heparin (Vitrum; fajlagos aktivitás : 130 egység/mg) 300 ml, a fentiekkel azonos összetételű pufferoldattal készített oldatához adjuk, és az elegyet 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután a gélt zsugorított üvegszűrőn vákuumban leszűrjük, és 10 x 200 ml, a fentiekkel azonos összetételű pufferoldattal mossuk. Az adszorbeáit heparint 3 x 200 ml, az 1. példában említettel azonos összetételű deszorbeáló pufferoldattal oldjuk le a gélről, majd az eluátumot fagyasztva szárítjuk. Sómentesítés céljából a kapott termék desztillált vízzel készített oldatát Spehadex G—25 gélen szűrjük, majd az eluátumot fagyasztva szárítjuk, 250 egység/mg fajlagos aktivitású, tisztított heparint kapunk. 3. példa Heparin tisztítása mátrixhoz kötött inter-a-tripszin-inhibitor felhasználásával Az adszorbens előállítása IX koagulációs faktort (B-faktort) Andersson és munkatársai módszerével [Thromb. Rés., 7, 451—459 (1975)] tisztítunk. A tisztítás során heparinmegkötő sajátságokkal rendelkező, körülbelül 150 000-es molekulasúlyú inter-a-tripszin-inhibitort különítünk el. 250 mg, így elkülönített fehérjét 200 ml 0,2 mólos nátrium-hidrogénkarbonát-oldatban oldunk, majd a kapott oldatot (pH=9,0) az 1. példában ismertetett módon brómciánnal aktíváit 50 ml ülepített Sepharose 4B gélhez adjuk. A szuszpenziót éjszakán át szobahőmérsékleten enyhén keverjük, majd a gélt az 1. példában ismertetett módon mossuk. Heparin tisztítása A fentiek szerint előállított adszorbenst oszlopba töltjük. 300 mg heparint (Vitrum) 20 ml, 0,05 mólos trisz-pufferoldat és 0,15 mólos nátriumklorid-oldat Hegyében (pH=7,4) oldunk, és az oldatot az oszlopba szivattyúzzuk. A gélt a fen ti összetételű pufferoldattal mossuk, majd az adszorbeáit heparint az 1. példában ismertetett deszorbeáló pufferoldattal leoldjuk. A sót Sephadex G—25 gélen desztillált víz jelenlétében végzett gélszűréssel eltávolítjuk, és az effluen&t fagyasztva szárítjuk. 230 egység/mg fajlagos aktivitású, tisztított heparint kapunk. Szabadalmi igény pontok 1. Eljárás heparin fajlagos aktivitásának növelését» tisztítással, azzal jellemezve, hogy a legfeljebb 150 egység/mg, előnyöse» 130 egység/mg fajlagos aktivitású 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
