176627. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3aalfa-h-4alfa-(3'-propionsav)-7abéta-metilhexahidro-1,5-indandion előállítására szitoszterin mikrobiológiai átalakításával
7 176627 8 magnézium-szulfát-heptahidrát 0,30 g/liter vas-triklorid.hexahidrát 0,05 g/liter desztillált víz (tetszés szerint) 1 literre kiegészítve 1 g/liter szójalisztet elegyítünk a táptalajba, majd 5 szitoszterint is adunk 10 g/liter mennyiségben a táptalajhoz. A lombikokat 20 percig 121 °C-on autoklávban tartjuk, majd 28 °C-on hűtjük és 10 ml oltott növekménnyel beoltjuk, amelyet a következőképpen állítunk elő: 10 Ab) részben előállított tisztított izolátumot agar ferde tenyészeteken tenyésztjük 28 °C-on. A ferdetenyészetből vett sejtkaccsal beoltunk egy 500 ml-es lombikot, amely 100 ml következő összetételű steril oltott táptalajt tartalmaz : 15 táptalaj (Difco) 8 g/liter élesztő kivonat 1 g/liter glicerin 5 g/liter desztillált víz (tetszés szerint) 1 literre kiegészítve 20 A pH-t 1 n nátrium-hidroxiddal 7-re állítjuk, mielőtt a lombikokat 121 °C-on 20 percig autoklávban tartanánk. A beoltott lombikokat 28 °C-on 72 óra hosszat inkubáljuk. 10 ml oltott növekménnyel beoltunk minden 500 ml-es 25 lombikot, amely 100 ml steril transzformációs táptalajt tartalmaz. A lombikokat 28—30 °C-on inkubáljuk rotációs rázó készüléken és különböző időközökben mintát veszünk. 10 ml-es mintákat elkülönítünk és 3 térfogat metilénkloriddal rázva extraháljuk. Az extraktu- 30 mok egyes adagjait egyrészt vékonyrétegkromatográfiásan szilikagélen analizáljuk a fent leírt oldószerrendszert: etil-acetát és cíklohexán 2:3 térfogatarányú elegyét alkalmazzuk futtató elegyként, másrészt gáz— folyadék kromatográfiásan analizáljuk. AII és V vegyü- 35 letek jelenléte azt igazolja, hogy az M. fortuitum ATCC 6842-ből termelt új mutáns szelektíven lebontja a szitoszterint. 2. példa Szitoszterin átalakítása I képletű vegyületté Az le példában használt táptalajt alkalmazzuk, azzal 45 a különbséggel, hogy a pH-t 4 n nátrium-hidroxiddal 7,5-re állítjuk. A táptalajt 121 °C-on 30 percig melegítve sterilizáljuk, majd 28 °C-ra hűtjük és beoltjuk M. fortuitum NRRL—B—8129 mutáns oltott tenyészetével, amelyet az le példában leírt módon állítunk elő. A be- 50 oltott elegyet 28 °C-on 168 óra hosszat inkubáljuk és közben a süllyesztett növekedést a keveréssel gyorsítjuk. A pH-t szükség szerint nátrium-hidroxid hozzáadásával 7—9-re állítjuk. A biotranszformáció előrehaladását úgy követjük nyomon, hogy a reakcióelegy mintáját 4 térfogat metilénkloriddal extraháljuk és a kivonatot vékonyrétegkromatográfiának vetjük alá szilikagél lemezeken, 60:40:1 térfogatarányú etilacetát—ciklohexán—jégecet oldószerrendszer alkalmazásával. A biotranszformáció befejezése után a kapott termékeket a következő módon izoláljuk. A reakcióelegyet telített nátriumhidrogénkarbonát hozzáadásával pH=8- ra állítjuk, majd metilénkloriddal extraháljuk. A II—V vegyületet tartalmazó, de I vegyületet nem tartalmazó extraktumot diatoma földön keresztül leszűrjük és a szűrletet szárazra desztilláljuk. A szűrletből származó maradékot kloroformban vesszük fel és szilikagélen kromatografáljuk, Skellysolve B-t és elegyeit alkalmazzuk és előhívószerként növekvő mennyiségű etilacetátot használunk. Ezzel a folyamattal a II, III és IV vegyületet eluáljuk azonban az V vegyületet nem, ez utóbbit metanol etilacetátos 5%-os oldatával eluáljuk az oszlopról. A vegyületek eluálási sorrendje II—III—IV—V. Az egyes termékeket úgy kapjuk, hogy a megfelelő frakciókat egyesítjük és vékonyrétegkromatografálással mutatjuk ki, majd szárazra pároljuk. Etilacetátból átkristályosítjuk és a II vegyület két epimerjének 1:1 arányú elegyét (op.: 100—112 °C), IV vegyületet (op.: 122— 124 °C) és V vegyületet (op.: 148—150 °C) kapunk. Az I képletű vegyületet jó termeléssel kapjuk, ha a hidrogénkarbonáttal kezelt elegy pH-ját koncentrált sósav oldattal pH=2-re állítjuk, kloroformmal vagy metilénkloriddal ismét extraháljuk és a ciklohexán lassú hozzáadásával a terméket kikristályosítjuk. Az I képletű vegyület 107—110 °C-on olvad. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás (I) képletű 3aoc-H-4a-(3'-propionsav)-7a ß-metilhexahidro-l,5-indiándion előállítására, azzal jellemezve, hogy Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Nocardia, Protaminobacter, Sérratia és Streptomyces, Mycobacterium, előnyösen Mycobacterium fortuitum NRRL—B—8129 mutáns mikroorganizmust, amely mutáns szelektíven bontja le a szitoszterint, vizes táptalajon 7—9 pH értéken aerob körülmények mellett szitoszterin jelenlétében tenyésztünk, és a kapott (I) képletű vegyületet elkülönítjük. 2. Az 1. igénypont szerint eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy Mycobacterium fortuitum NRRL—B—8129 mikroorganizmust vizes táptalajon 7—9 pH értéken aerob körülmények mellett szitoszterin jelenlétében tenyésztünk, és a kapott (I) képletű vegyületet elkülönítjük. 3. Az 1. igénypont szerint eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy 7,5 pH értékű táptalajt alkalmazunk. 1 db ábraoldal ________A kiadásért fcM; » Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 81.1241.66-4Ä Alfa® Nyomda, Debrecen — FéWSs vezető: Bonkő István igazgató 4
