176627. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3aalfa-h-4alfa-(3'-propionsav)-7abéta-metilhexahidro-1,5-indandion előállítására szitoszterin mikrobiológiai átalakításával
3 176627 4 hogy szitoszterint szelektíven lebontunk és főleg I képletű vegyületet halmozunk fel a fermentlében. Ezeket a mutánsokat a következő nemekhez tartozó szterin-bontó mikroorganizmusokból kapjuk az itt leírt mutációs eljárással vagy más ismert mutációs eljárásokkal: Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia és Streptomyces. Előnyös genus a Mycobacterium. Ehhez a nemhez tartoznak a következő fajok: M. phlei, M. smegmatis, M. rhodochrous, M. mucosum, M. fortuitum, és M. butyricum. Külön megemlítjük mutáns mikroorganizmusként a Mycobacterium fortuitum NRRL—B—8129-et, melyet az I képletű vegyület előállítására, azaz szitoszterin lebontására alkalmazunk. A szteroid tiszta, vagy nyers formában is alkalmazható. , A fermentlében található kis mennyiségű II képletű 3aa-H-4a-(3 '-propanol)-7a ß-metilhexahidro-1,5 -indándion hemiketál, ezentúl II vegyületnek nevezzük, valamint III képletű 3aa-H-4a-(3'-propanol)-5a-hidroxi-7a ß-metilhexahidro-1-indanon hemiacetál nyomai, ezentúl III vegyületnek nevezzük, IV képletű 3aa-H-4oc-(3'-propíonsav)-5a-hidroxi-7a ß-metilhexahidro-1 -indanon-falakton, továbbiakban IV vegyület, valamint az V képletű 3a<z-H-4x-(3 '-propanol)-5a-hidroxi-7a 8-metilhexahidro-l-indanon, továbbiakban V vegyület. A mikroorganizmusok A szitoszterin szelektív lebontására és a fermentlében túlnyomórészt I képletű vegyületet felhalmozni képes mutánsokat úgy állíthatunk elő, hogy a következő fajok szterinlebontó mikroorganizmusait mutáljuk: Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia, és Streptomyces. A Mycobacterium fortuitum ATCC 6842-t mutálva laboratóriumi mutáns mikroorganizmust kapunk. Az 1974-es ATCC katalógus a következőket írja az ATCC 6842-ről: J. C. Cruz 2. Cold abscess. Acta Med. Rio de Janeiro 1:1 (1936). Medium 90 37C. Az M’. fortuitum, ATCC 6842 a szterineket nem szelektíven bontja le kismolekulasúlyú vegÿületekre például C024-H20-ra. így ez a mikroorganizmus nem alkalmas a szteroidok szelektív lebontására. Az M. fortuitum ATCC 6842 nitrozo-guanidinnel történő mutálásával olyan mutánst kapunk, amely szelektíven bontja le a szitoszterint, valamint túlnyomórészt I képletű vegyületet termel a fermentlében. Az M. fortuitumnak ezt a mutáns mikroorganizmusát NRRL—B—8129 deponálási számon deponáltuk a Northern Regional Research Laboratory U.S. Department of Agriculture, Peoria Illinois, amerikai egyesült államokbeli deponáló helyen. Az M. fortuitum NRRL—B—8129 morfológiája és gyógyszer érzékenysége különbözik az eredeti M. fortuitum ATCC 6842-től. Mindkét M. fortuitum tenyészet az Actinomycetales rend Mycobacteriaceae családjához tartozó saválló, nem-mozgó, nem spóraképző bacillus. Runyon osztályozása szerint (Runyon, E. H. 1959 Med. Gin. - North America 43:273) nem-kromogén' IV mycobacterium csoport, azaz alacsony hőrdérsékleten gyorsan nő és viszonylag egyszerű táptalajon nem-színezetttelepeket termel. Az M. fortuitum ATCC 6842 és az M. fortuitum NRRL B—8129 tisztán megkülönböztethetők a szteroid molekulákra gyakorolt hatásukban. Mint már fent említettük, az M. fortuitum ATCC 6842 lebont szteroidokat, de az M. fortuitum NRRL—B—8129 szelektíven bontja le a szteroidokat. Ez a tulajdonsága teszi az M. fortuitum NRRL—B—8129-et olyan hasznossá. Az M. fortuitum ATCC 6842 mutálását M. fortuitum NRRL—B—8129-é nitrozo-guanidinnel végezzük. Az eljárás részletei alább következnek. Bár az irodalomból a mutációs eljárások általában ismertek, még sincsen utalás az irodalomban a mutánsok típusára, melyeket a jelen mutációs eljárással kaphatunk. Bár a jelen eljárás mutációs és transzformációs lépéseit Mycobacteriumra írjuk le részletesen, magától értetődő, hogy más nemekhez tartozó mikroorganizmusokhoz is használhatunk hasonló vagy ekvivalens eljárásokat. A transzformációs eljárás A találmány szerinti szelektív transzformációt M. fortuitum NRRL—B—8129 növekvő tenyészetében hajtjuk végre vagy oly módon, hogy az inkubációs periódus alatt a szitoszterint a tenyészethez adjuk vagy beoltás előtt a táptalajba helyezzük. A szteroidot önállóan vagy más szteroiddal kombinálva alkalmazhatjuk. A szitoszterint előnyösen 0,1—100 g/Iíter koncentrációban alkalmazzuk a tenyészetben. A Tenyészetet szénforrást, például asszimilálható szénhidrátot, nitrogén forrást, i^dáűL asszimilálható nitrogénvegyületet vagy fehérjét tartalmazó táptalajon végezzijK. Előnyös szénforrások a kö^stkezők/igíükéz, barna cukor, szacharóz, glicerol, keményítő, kukoricakeményítő, laktóz, dextrin, melaszok stb. Előnyös nitrogénforrások a következők: kukoricaszárkivonat, élesztő, autolizált Brewer-féle élesztő tejporral, szójaliszt, gyapotmagliszt, kukoricaliszt, tejpor, kazein hasnyálmirigy kivonat, halliszt, karbamid, lepárlási termékek, állati pepton folyadékok, hús és csont darabok, ammonium sók stb. Előnyösen ezeket a szén és nitrogénforrásokat kombinációban is használhatjuk. Nyomelemeket például' cinket,* magnéziumot, mangánt, kobaltot, vasat stb. nem szükséges a fermentációs táptalajhoz adni, mert csapvizet és nem tisztított komponenseket alkalmazunk a táptalaj alkotóelemeként. A táptalaj sterilizálása előtt a pH-t 7 fölé, előnyösen 7—9 érték közé állítjuk. A pH-beállítást erős bázissal, például nátriúm-hidroxiddal, kálium-hidroxiddal stb. végezzük. A találmány szerinti eljárás kritikus vonása a pH 7 fölött való tartása a fermentáció alatt, hogy főleg I képletű vegyületet kapjunk. A pH fenntartását az irodalomból ismert módszerekkel végezhetjük például kalciumkarbonátot, vagy foszfát puffert teszünk a táptalajba vagy egy bázissal például nátrium-hidroxiddal vagy ammónium-hidroxiddal szabályozzuk a pH-t. A transzformációs eljárás 72 órától 15 napig is tarthat. A transzformációs eljárás alatt az inkubációs hőmérséklet 25—37 °C között változhat, előnyösen 31 °C. A transzformációs edény tartalmát sterilizált levegővel levegőztetjük, és a mikroorganizmus növekedésének elősegítésére keverést alkalmazunk és így a transzformációs eljárás hatékonyságát serkentjük. A transzformációs eljárás befejeződését szilikagélen (Merck, Darmstadt) végzett vékonyrétegkromatográfiával követjük nyomon, oldószer-rendszerként 60: 40:1 térfogatarányú etil-acetát, ciklohexán, jégecet elegyet 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
