176580. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enzimek és enzimkeverékek rögzítésére kopolimer réteg(ek)ben
3 176580 4 zikai kötésekkel történő immobilizálás — terjedt el. Az első csoportba a következő eljárások tartoznak : a) az aktív molekulák és a közegben nem oldódó hordozó közötti kovalens kötések kialakítása, b) az aktív molekulák kopolimerizációja kis molekulasúlyú monomerrel, c) az aktív részecskék közötti kovalens kötések létrehozása multifunkciós (legalább bifunkciós) kismolekulájú reagensek segítségével. Ezek az eljárások az aktív részecskék kémiai módosításával járnak együtt, amely általában aktivitásuk jelentős csökkenését vonja maga után. A fizikai úton történő immoblizálás legelterjedtebb változatai a következők: a) az aktív részecskék adszorpciója a közegben nem oldódó hordozó felületén, b) az immobilizálandó molekula bezárása a közegben oldhatatlan, pórusos hordozóba, c) az aktív anyagok ún. mikrokapszulákba zárása. Gyakorlati szempontból a fizikai úton történő immobolizálás a kívánatos, mivel a környezeti hatásokra általában rendkívül érzékeny részecskék kíméletes — kémiai kötés kialakítása nélküli — rögzítését teszi lehetővé, továbbá a kémiai módszereknél sokkal általánosabban alkalmazható. A fizikai úton történő rögzítés legegyszerűbb módja az aktív molekulák szilárd felületen történő adszorpciója. Az enzim molekulák adszorpciója a szilárd/folyadék határfelületen jelentősen függ az oldat töménységétől, a pH-tól, az ionerősségtől, az oldószer minőségétől, az adszorbens mennyiségétől és minőségétől, valamint a hőmérséklettől. Nem biztos, hogy az adszorpció számára optimális körülmények az enzim aktivitásának megőrzése szempontjából is megfelelőek. Számítani kell továbbá az adszorbeált aktív részecskék deszorpciójára is, ami a katalitikus aktivitás csökkenését okozza. Kimutatták, hogy pl. a nitrocellulóz hordozóra adszorbeált polinukleotidfoszforiláz aktivitása egy hét alatt 4 °C-on tárolva a kezdeti érték 50%-ára csökken (Thang et. al. Biochem. Biophys, Res. Commun. 31, 1, 1968.). Az aktív részecskék pórusos hordozóba, illetve mikrokapszulákba történő bezárása esetén az immobilizált anyag a hordozó belsejében levő üregekben foglal helyet. Az üregek fala az aktív molekulák számára átjárhatatlan, ezért ezek nem tudnak a falon keresztül az oldatba diffundálni, ugyanakkor azonban a kisebb méretű szubsztrát, illetve termék molekulák át tudnak hatolni a falon. Ezzel biztosítható, hogy az enzim molekulák természetes környezetükhöz nagyon hasonló kémiai környezetben fejthessék ki hatásukat. Az enzimek bezárásának további előnye, hogy fokozott védelmet biztosít a molekulák számára a közegben oldott, nagy molekulájú károsító anyagokkal szemben, általában növeli hőstabilitásukat, s az ilyen módon immobilizált enzimek viszonylag hosszú ideig megőrzik aktivitásukat. Kimutatták, hogy a poliakrilamid gélbe zárt Ribonukleáz A aktivitása egy hónap alatt mindössze 1%-ot csökkent (Bemfeld and Wan, Science, 142, 678, 1963.), míg a glükózoxidáz enzim esetében három hónap alatt sem következett be mérhető aktivitáscsökkenés (Hicks and Updike, Anal. Chem. 38, 726, 1966.). A poliakrilamidon kívül enzimek bezárására más anyagokat — szilikongumi, szilikagél, keményítő gél, polivinilalkohol gél, hidroxietilmetakrilát gél — is alkalmaztak. Az immobilizálás hatékonysága, azaz az enzim aktivitásának megőrzése a bezárás során, nagymértékben függ a kísérleti körülményektől. A reakciókörülmények, a gélképzés során használt vegyszerek, továbbá a folyamatban keletkező nagy reakcióképességű szabad gyökök jelentősen károsíthatják az aktív anyagot. Amennyiben a térhálósítás radioaktív sugárzással történik (Maeda et. al. Biotechnoi. Bioeng. 15, 607, 1973.), ez ugyancsak az aktivitás számottevő csökkenéséhez vezethet. Az eljárás további hátránya, hogy a gélképződés során különböző méretű üregek (pórusok) keletkeznek. A nagyobb pórusokból az aktív molekulák az oldatba diffundálhatnak, s ezáltal az immobilizált anyag mennyisége és a mérhető aktivitás is csökken. Találmányunk célja olyan általánosan alkalmazható, könnyen kivitelezhető eljárás megvalósítása, amely lehetővé teszi aktív részecskéknek polimer térhálókban fizikai úton történő rögzítését, a korábban alkalmazott immobilizálási folyamatok során fellépő fizikai, illetve kémiai károsító hatások elkerülését, valamint a diffúzió útján bekövetkező anyagveszteség minimálisra való csökkentését. A találmány további célja a biológiailag aktív részecskék számára a természetes környezetükhöz hasonló kémiai környezet kialakítása révén a külső fizikai és kémiai hatások (pl. hőmérséklet hatás, idegen anyagok hatása) elleni védelmük fokozása, továbbá többszörösen összetett aktív rétegek (szendvics-szerkezet) létrehozásának biztosítása. Ez utóbbi pl. több lépéses katalitikus folyamatok esetén a közti termékek mennyiségének széles határok közötti szabályozásának lehetőségét teremti meg, valamint elméleti szempontból pl. több komponensű enzimrendszerek működési mechanizmusának felderítése vonatkozásában is alapvető jelentőségű. A találmány alapját azok a felismerések képezik, hogy a vízben oldódó aktív részecskék aktivitása azután is megmarad, ha egy megfelelően választott vinilalkohol-viniléter, vinilalkohol-vinilészter, illetve vinilalkohol-vinildiacetál típusú kopolimernek az aktív anyagot is tartalmazó oldatából beszárítással filmet készítünk, illetve ha az ilyen filmre a kopolimer aktív anyagot nem tartalmazó vizes oldatát rászárítjuk; továbbá, hogy az így készült filmek vízbe, illetve a megfelelő közegbe helyezve nem oldódnak fel, hanem csak kis mértékben duzzadnak. Ezek a felismerések több szempontból is meglepőek. Az lenne várható ugyanis, hogy a beszárítás során keletkező kis pórusú gél megakadályozza a szubsztrát molekuláknak a pórusokba 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
