176294. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antigének és antitestek meghatározására
17 176294 18 keverjük szobahőmérsékleten, majd 40 °C-ra melegítjük, és további 30 percig keverjük ezen a hőmérsékleten, végül pedig 2—4 °C-ra hűtés közben centrifugáljuk 50 percig 12000/perc fordulatszámmal. A csapadékot dekantálással elválasztjuk, és az antifibrinogén-antitesttel érzékenyített latex-részecskéket 0,2 súly% koncentrációjú marhaszérum-albumin-oldatban szuszpendáljuk. Ilyen módon antifibrinogénnel érzékenyített latex-reagenst kapunk, amely 1 súly% koncentrációban tartalmazza az érzékenyített latex-részecskéket. (2) Kalibrációs görbe felvétele 7 mm belső átmérőjű és 70 mm hosszúságú műanyag kémcsőbe 0,1 ml antifibrinogén-latex-reagenst (amelyet az (1) pontban leírtak szerint készítünk) és 0,3 ml standard fibrinogén-oldatot (amely fiziológiás nátriumklorid-oldattal készült és 0,2 súly% marhaszérum-albumint tartalmaz) rétegezünk, amely az I. táblázatban megadott koncentrációban tartalmazza a fibrinogént. Az elegyet 20 percig rázatjuk rázógépen, percenként 200 rázatás alkalmazásával, hogy az antigén-antitest reakció végbemenjen. Közvetlenül ezután a kémcsőben jelenlevő reakcióelegyet 2 mm szélességű fényabszorpciós üvegküvettába töltjük át, és 1,2 mikrométer hullámhosszúságú fény alkalmazásával meghatározzuk az extinkcióját automatikus spektrofotográf segítségével (Hitachi Ltd., Modell EPS-3). összehasonlító oldatként egy olyan szuszpenziót alkalmazunk, amelyet 0,1 ml antifibrinogén-latex-reagéns 0,3 ml fiziológiás nátriumklorid-oldattal történő hígításával kapunk, és amely 0,2 súly% marhaszérum-albumint tartalmaz. A mérést az L táblázatban megadott minden egyes standard fibrinogén-oldattal kétszer végezzük el. A kapott eredményeket az I. táblázat tartalmazza. I. Táblázat A standard Extinkció 1,2 mikrométeren fibrinogénoldat koncentrációja mikrogramm/ml 1. mérés 2. mérés középérték 0,1 0,336 0,363 0,350 0,2 0,836 0,778 0,807 0,3 1,083 1,167 1,125 0,4 1,330 1,333 1,332 0,5 1,403 1,430 1,417 Ha az I. táblázatban feltüntetett értékeket grafikusan ábrázoljuk, mégpedig a standard fibrinogén-oldat koncentrációját az abszcisszán, az 1,2 mikrométer hullámhosszúságú fénnyel kapott extinkciót (középérték) pedig az ordinátán, akkor a 7. ábrán látható kalibrációs görbéhez jutunk. (3) Fibrinogén kvantitatív meghatározása ismeretlen mintákban Vérmintát, vizeletmintát vagy a mellkasban (mellhártyatérben) levő folyadékból mintát veszünk a betegtől, és vérminta esetén a szérumot vagy plazmát elválasztjuk. A minta vagy a hígított minta 0,3 ml alikvot részéhez 0,1 ml antifibrinogén-latex-reagenst adunk (amelyet az (1) pontban leírtak szerint készítünk el), majd pedig a (2) pontban megadott eljárás alkalmazásával meghatározzuk az extinkciót. A (2) pontban ismertetett módszer segítségével felállított kalibrációs görbéről leolvassuk a mért extinkció-értéknek megfelelő fibrinogén-koncentrációt. Az ilyen módon kapott eredményeket a II. táblázat tartalmazza. összehasonlítási célokra a II. táblázatban azokat az értékeket is feltüntettük, amelyeket az ismert radioimmun-vizsgálati módszer [S.M. Ratkey és munkatársai, Brit. J. Haematol., 30, 145—149 (1975)], valamint az ismert tárgylemezes módszer [Fujimaki, Tamura és Takahashi, Rinsho Kagaku (Clinical Science), 12, 507 (1976) és Fujimaki, Ikematsu, Takeuchi és Kató, Rinsho Byori (Japanese Journal of Clinical Pathology), 21,973 (1973)] szolgáltatott. A II. táblázatban megadott eredményekből látható, hogy a találmány szerinti eljárás segítségével kapott fibrinogén-koncentrációértékek gyakorlatilag jól egyeznek az ismert meghatározási módszerek közül a legpontosabbnak tekintett radioimmun vizsgálati módszerrel kapott eredményekkel. A korrelációs együttható a találmány szerinti eljárás és a radioimmun-vizsgálati módszer között 0,999. 2. példa Az 1. példa (1) pontjában leírt módon 1 súly% latex-részecskéket tartalmazó antifibrinogénnel érzékenyített latex-reagenst készítünk, azzal az eltéréssel, hogy 0,234 mikrométer átlagos részecskeátmérőjű polisztirol-latexet használunk (amely a Dow Chemical Co. cégtől szerezhető be, és a szüárdanyag-tartalma 10 súly%). A kapott, antifibrinogénnel érzékenyített latex-reagensből 0,1 ml alikvot részt 0,3 ml standard fibrinogén-oldattal elegyítünk (amely literenként 0,5 mikrogramm fibrinogént tartalmaz), és az elegyet 5 percig rázatjuk szobahőmérsékleten rázógépen, 250 rázás/perc sebességgel, hogy végbemenjen az antigén-antitest reakció. Végül meghatározzuk a reakcióelegy extinkcióját 1,2 mikrométer hullámhosszúságú fény alkalmazásával, az 1. példa (2) pontjában megadott módon. A mérés reprodukálhatósága vizsgálatára még háromszor megismételjük a vizsgálatot. A kapott eredményeket a III. táblázat tartalmazza. A fenti meghatározásokat újból megismételjük, azzal az eltéréssel, hogy a standard fibrinogén-oldatok helyett betegektől vett vérmintákból elkülönített szérumokat használunk. Ugyanezt a meghatározási módszert négyszer alkalmazzuk, különböző napokon, hogy megállapíthassuk a testfolyadék mérésének reprodukálhatóságát. A kapott eredményeket szintén feltüntetjük a III. táblázatban. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
