176250. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 12ß-hidroxikardenolid-származékok mikrobiológiai előállítására
15 176250 16 10. példa Mindenben az 1. példa szerint jártunk el, de adagolás után a fermentációt két nap után állítottuk le. A fermentlevet kloroformmal extraháltuk. Az 5 extraktumról felvett vékonyrétegkromatogramon kevés át nem alakult lanatozid-A szubsztrátumon kívül jelentős mennyiségű acetildigitoxint, acetildigoxint, digitoxint és kevés digoxint azonosítottunk. 11. példa Streptomyces purpurascens KA—43 (MNG 178) jelű törzs 3—4 hetes burgonyás-dextrózos ferdeagaron 15 nőtt tenyészettéről 10 ml steril vízzel szuszpenziót készítettünk. A szuszpenzió 1 -1 ml-ével 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban sterilezett 100—100 ml PS jelű táptalajt oltottunk. A lombikokat 32°C-on rázattuk 2 napig, majd 4 lombik összeöntött tartalmával 20 oltottunk 5 liter, laboratóriumi fermentorban 60 percig 120°C-on sterilezett, 0,2% pálmaolajat is tartalmazó PS táptalajt. A beoltott fermentort 32 °C-os vízfürdőben, 5 liter/perc steril levegő átáramoltatás és 350/perc 25 fordulatszámú kevertetés mellett egy napig inkubáltuk, majd a tenyészethez 5 g lanatozid-A 25 ml dioxánban készült, sterilre szűrt oldatát adagoltuk. További 5 nap inkubálás után a : fermentlét szűrtük. A sejtmentes szűrletet kétszer 1/3 térfogatnyi 30 benzollal extraháltuk. (A benzolos extraktum tartalmazza az esetlegesen át nem alakult szubsztrátumot, valamint digitoxint mint közbenső terméket, illetve a melléktermékek egy részét. Ezt követően a fermentlevet háromszor 1/3 térfogatnyi kloroformmal extrahál- 35 tűk. Az extraktumot vízmentes nátriumszulfáttal szárítva és szűrve, vákuumban 50 °C-nál nem magasabb hőmérsékleten .szárazra pároltuk. Az így kapott 2,1 g szárazmaradék 40% digoxint, 14% 7/3-hidroxidigoxint és további 20% nem azonosított szerkezetű glükozidot tartalmazott. Lanatozid-A, acetildigitoxin, illetve acetildigoxin a szárazmaradékban nem volt. A fenti összetételű kloroformos extraktum szárazmaradékát 60 ml metanol és 60 ml benzol elegyében feloldottuk, és 400 mg fenilbórsavat adva hozzá 5 percen keresztül reagáltattuk. Állandó keverés mellett 60 ml vizet adtunk a reakcióelegyhez. A fázisok szétválása után az alsó vizes-metanolos fázist elválasztottuk, majd 60 ml benzollal extraháltuk. Az alsó fázist leválasztva a metanolt vákuumban 50 °C-nál nem magasabb hőmérsékleten eltávolítottuk, a kivált kristályos anyagot szűrtük, 60 ml vízzel mostuk, majd szárítottuk. így 0,75 g kristályos digoxint nyertünk. [a]lS6 = +13,6° (c = 10%, piridin). Szabadalmi igénypont: Eljárás I általános képletű - ahol X jelentése hidroxil-csoport, Y jelentése hidrogénatom vagy hidroxil-csoport, és R jelentése IV vagy V képletű csoport — kardenolidok előállítására mikrobiológiai úton, azzal jellemezve, hogy valamely I általános képletű — ahol X jelentése hidrogénatom vagy hidroxil-csoport, Y jelentése hidrogénatom és R jelentése II, III, IV vagy V képletű csoport — kardenolidot Streptomyces purpurascens KA—26 (MNG 179) vagy Streptomyces purpurascens KA—43 (MNG 178) vagy Streptomyces purpurascens KA—82 (MNG 177) vagy Streptomyces purpurascens KC—157 (MNG 176) vagy Streptomyces alboniger AB—318—ST (MNG 180) törzsek süllyesztett tenyészetével fermentáljuk, és az átalakított terméket vagy termékeket a fermentléből önmagában ismert módon elkülönítjük. 40 2 ábraoldal A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 814080 - Zrínyi Nyomda, Budapest
