176249. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kardenolid-származékok mikrobiológiai átalakításánál a fermentlé szubsztrátum- koncentrációjának növelésére

5

176249

6

Színreakció. A bejelölt foltokat csiszoltdugós kémcsövekbe kaparjuk, és 3 ml dixantilkarbamidos reagenst mérünk rájuk, majd lezárva és alaposan felrázva a kémcsöveket 100 °C-os vízfürdőbe helyezzük 3 percre. Ezt követően a kémcsöveket hideg vízfürdőben lehűtjük, és a felrázott szuszpenziót élesre centrifugáljuk. A tiszta felülúszó színintenzitását 535 mm-en mérjük glükozidot nem tartalmazó oldattal szemben.

A glükozidot nem tartalmazó oldatot az illető glükozid foltjának magasságában, az azzal azonos területű, de glükozidot nem tartalmazó — „üres” — foltnak a rétegről való lekaparásával a fent leírt módon készítjük.

A mért extinkcióból az esetleges hígítás és a felvitt térfogat figyelembevételével, a standard koncentrációgörbéből kapott szorzószám segítségével az egyes glükozidok koncentrációját kiszámítjuk.

Dixantilkarbamidos reagens: 10 mg dixantilkarbamidot 50 ml ecetsav és 1 ml koncentrált sósav elegyében oldunk, és az oldatot ecetsavval 100 ml-re kiegészítjük. A reagenst a mérés előtt minden esetben frissen készítjük el. A mérések eredményeit az 1. táblázatban foglaljuk össze.

1.táblázat

Digoxin- és

Lombik Digitoxin 7j3-hidroxiszáma -digoxin

tartalom mg-ban

1.

0

60

2.

kevesebb mint 5

41

3.

5

54

4.

8

38

5.

5,6

50

6.

6,3

35

7.

7

35

8.

9

37

2. példa

Az 1. példában leírt módon eljárva, de a szuszpenziókat Streptomyces purpurascens KA—26 MNG, 179, Str. purpurascens KA-43, MNG178, Str. purpurascens KA—82, MNG 177, Str. purpurascens KC-157,MNG 176, illetve Str. alboniger AB 318—ST, MNG 180 tenyészetéről készítjük. A mérések eredményei alapján a digitoxin 20—30% digoxin- és 7j3-hidroxi-digoxin képződés közben átalakul.

3. példa

A 2. példában leírt módon járunk el, de szubsztrátumként acetil-digitoxint vagy lanatozid-A-t

adagolunk. A mérések a szubsztrátumok 80—90%-os átalakulását mutatják. A termék digoxin és 7/3-hidroxi-digoxin.

5 4. példa

Streptomyces purpurascens KA—82, MNG 117 jelű törzs 5—6 hetes burgonyás-dextrózos ferdeagaron nőtt tenyészetéről 10 ml steril vízzel szuszpenziót 10 készítünk. A szuszpenzió 1—1 ml-ével 500ml-es Erlenmeyer lombikokban sterilezett 100—100 ml MK jelű táptalajt oltunk.

MK táptalaj összetétele:

2% mogyoróliszt 15 3% kukorica keményítő

pH = 7,0 (sterilezés előtt). Sterilezés 60 percig 120 °C-on. A beoltott lombikokat 32 °C-on rázatjuk két percig, majd a tenyészet 10-10 ml-ével újabb MK táptalajt tartalmazó lombikokat oltunk. A 20 lombikokhoz 1 nap növesztés után 100—100 mg lanatozid-A-t 0,5 ml tetrahidrofurán és 0,5 ml dimetilacetamid, illetve 0,5 ml tetrahidrofurfurilalkohol és 0,5 ml dimetilszulfoxid, illetve 0,5 ml dioxán és 0,5 ml dimetilformamid, illetve 0,5 ml piridin és 25 0,5 ml hexametilfoszforsavtriamid, illetve 0,5 ml ; piridin és 0,5 ml tetrahidrofurán, illetve 0,33 ml tetrahidrofurán, 0,33 ml dioxán és 0,33 ml dimetil formamid, illetve 0,33 ml tetrahidrofurfurilalkohol, 0,33 ml dimetilszulfoxid és 0,33 ml dimetilacetamid elegyé- 30 ben oldva. Adagolás után a lombikokat tovább rázatjuk 32 °—on 4 napig, majd az 1. példában leírt módon meghatározzuk a tenyészetek glükozid tartalmát. A mérések valamennyi lombikban a lanatozid-A 90—100%-os átalakulását mutatják. A termék 35 10-15% digitoxin mellett digoxin és 7/3-hidroxidigoxin.

Szabadalmi igénypontok:

40 1. Eljárás fermentlé szubsztrátum-koncentrációjának növelésére az I általános képletű kardenolidok - ahol X jelentése hidrogénatom, vagy hidroxil-csoport, R jelentése II, III, IV vagy V képletű csoport — mikrobiológiai átalakításánál az átalakítandó vegyüle- 45 tek szerves oldószerben történő adagolása útján, azzal jellemezve, hogy az I általános képletű kiindulási vegyületeket — ahol X jelentése hidrogénatom vagy hidroxil-csoport, R jelentése II, III, IV vagy V képletű csoport — elektrondonor sajátságú, vízzel elegyedő és 50 az adott vegyületet 5—20%-ban oldó szerves oldószerben, vagy ilyen oldószerek elegyében juttatjuk a fermentlébe.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy oldószerként tetrahid- 55 rofuránt, tetrahidrofurfurilalkoholt, dioxánt, dimetilformamidot, dimetilaeetamidot, dimetilszulfoxidot, piridint vagy hexametilfoszforsavtriamidot vagy ezek keverékét használjuk.

2 ábráddal

A kiadásért felei: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 814080 - Zrínyi Nyomda, Budapest

3