176225. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükagon kinyerésére az inzulin-előállítás során alkalmazott lúgos kristályosítás során keletkezett felülúszóból
11 176225 12 centrifugálással összegyűtjük és a fentiek szerint etilén-diamin-tetraacetátot és ammónium-szulfátot tartalmazó savas fenolos vízzel mossuk. A glukagonszálakat 0,2% (súly/térfogat) fenolt tartalmazó 10 liter vízben szuszpendáljuk. A keveréket 40°-ra melegítjük és a pH-t 150 ml 10%-os vizes kálium-hidroxid-oldattal 10,5-re állítjuk be. Ezután az oldatot 60°-ra melegítjük és pH-ját 68 ml 10%os foszforsavoldattal 7,8-ra állítjuk be. Miután az oldat hőmérséklete elérte a 60°ot, a pH-t 68 ml 10%os foszforsavoldattal 5,0-re állítjuk be. Az oldatot még melegen szüljük és a szűrletet 72 óráig 5°-on keverjük. A kivált glukagont szűréssel izoláljuk. A kapott szilárd anyagot a glukagonszálakra fentebb leírt módon oldjuk, a pH-t 10,5-re beállít- 15 va az össztérfogat 870 ml. Az oldatot 60°-ra melegítjük, a pH-t 10%os foszforsavval 5,0-re állítjuk be és a kapott oldatot melegen szüljük. A szűrletet a fentiek szerint lehűtjük és keverjük. A kivált glukagont centrifugálással összegyűjtjük, majd lioíi- 20 lizáljuk, 1,84 g tisztított glukagont kapunk. Ez a szálképzés előtt rendelkezésre álló glukagon 74%-ának és a lúgos kristályosításkor kapott felülúszó fehérjeinek kicsapása után meglevő glukagon 39%-ának felel meg (számításba véve a mintavételeket). 25 2. példa 29,380 kg, 36,900 kg és 48,520 kg szarvasmar- 30 ha/sertés-hasnyálmirigyből (2 :1 keverék) származó inzulin feldolgozásának három lúgos kristályosítási anyalúgját (pH = 7,6) centrifugálással elválasztjuk az inzulinkristályoktól. A megfelelő 460 liter 515 liter és 680 liter térfogatú anyalúgokhoz 51 liter, 57,2 liter 35 illetve 75,5 liter abszolút alkoholt adunk és pH-jukat 3 n sósavoldattal 5,0-re állítjuk be, 15 percig keverjük és legalább 24 óráig hidegen tartjuk. A kicsapás előtti anyalúg és a feloldott csapadék elemzése: 40 1. az anyalúgban: 2530 pg glukagon és 501,6 E inzulin/kg eredeti pankreász-szövet, a csapadék 158 liter oldatában 1846 meg glukagon és 651 E inzulin/kg eredeti pankreász-szövet, 131,34 mg szilárd anyag/kg eredeti pankreász-szö- 45 vet, 2. az anyalúgban 1619 pg glukagon és 305,8 E inzulin per kg eredeti pankreász-szövet, a csapadék 150 liter oldatában 759 meg glukagon és 270,6 E inzulin/kg eredeti pankreász-szövet és 50 61,16 mg szilárd anyag/kg pankreász, 3. az anyalúgban 2670 pg glukagon és 480 E inzulin per kg eredeti pankreász-szövet, a csapadék 15*6 liter oldatában 2081 pg glukagon és 420 E inzulin/kg eredeti pankreász-szövet és 55 130 mg szilárd anyag/kg eredeti pankreász-szövet. A csapadékokat szűréssel összegyűjtjük és az 1. példa szerint előállított savas fenolos vízben oldjuk. 60 A pH 5,0-nél végzett kicsapással kapott csapadékok oldatait egyesítve 464 liter oldattérfogatot (12,570 g szilárd anyag) kapunk, melyet 630 literre hígítunk savas fenolos vízzel. A 2,0% szilárd anyagot tartalmazó oldat pH-ját 3 n sósavoldattal 2,1-re 65 állítjuk be. Az oldatot 0,3%- ammónium-szulfáttal kezeljük és 24 óráig 25°-on keverjük, majd 48 óráig 15°-on állni hagyjuk. A képződött glukagonszálakat az oldatból centrifugálással választjuk el. A felülúszó oldatból próbát veszünk (488,4 pg glukagont és 251 E inzulint tartalmaz eredeti hasnyálmirigy-szövet kilogrammonként) és visszavezetjük az inzulinelőállító folyamatba. A glukagonszálakat 0,2% fenolt tartalmazó 450 literihideg vízben szuszpendáljuk, hozzáadunk 2,700 ml 50%-os ammónium-szulfát-oldatot és a szálak mosása céljából a keveréket 30 percig lassan keverjük, a szálakat centrifugálással újra összegyűjtjük és a mosófolyadékokat elöntjük. A glukagonszálakat 0,2% fenolt tartalmazó 275 liter vízben szuszpendáljuk és a pH-t 10%-os foszforsavval 3,85-re állítjuk be. Elemzés: Szilárd anyag: 12,05 mg/kg eredeti hasnyálmirigy-szövet (0,52%, 1,404 g 115 kg eredeti hasnyálmirigyszövetből, glukagon: 466,4 pg/kg eredeti hasnyálmirigy-szövet (54,2 g). A 275 liter glukagonszál/szuszpenziót az első kristályosításhoz 1/135 literes és 2/140 literes részre osztjuk* Az első részt 0,2% fenol-vízzel 140 literre hígítva a szilárd anyag koncentrációját 0,5%-ra állítjuk be, a második rész szilárd anyag koncentrációja 0,52%. Mindkét szál-szuszpenziót 60°-ra melegítjük és pH-jukat 9,0—11,0-re állítjuk be (az l)rész pH-ja 9,9, a 2) részét 9,7) 10%-os kálium-hidroxid-oldattal. Az áttetsző oldathoz 281 g Norite A-szűrősegédanyagot adunk (0,4 g/g szilárd anyag) és 10 perc keverés után az oldat pH-ját 10%-os foszforsavval 5,0-re állítjuk be, majd melegen szűrőpapírral ellátott tölcséren leszűijük. A szűrletet lassan, 4°-os hűtés közben 16—20 óráig keverjük a glukagon egyenletes kikristályosodásának az elősegítése céljából. A szűréssel pH 5,0-nél, 60°-on elválasztott csapadékot további glukagonkristályok nyerése céljából 120 liter 0,2%-os fenolos vízben szuszpendáljuk (0,5%) szilárd anyag koncentráció), 60-ra melegítjük, a szilárd anyag oldása céljából pH-t 10,0-re állítjuk be, 10 percig keverjük, a pH-t 10%-os foszforsavval 5,0-re állítjuk be és melegen szűrjük. A szűrletet 40°-on 16—20 óráig keverjük. A kristályosodás 72—120 óra alatt lezajlik. A második, pH 5,0-nél kapott csapadékot elöntjük. Az első és a második kristályosítás anyalúgjának főtömegét dekantáljuk és szívatással leszűrjük. Az első anyalúgot mindkét esetben 20%-os (súly/térfogat) nátrium-klorid-oldattal kezeljük a ki nem kristályosodott glukagon kicsapása céljából. A csapadékokat egyesítjük más sarzsokkal és pH 4,6-on való ismételt kicsapás után újabb kristályosítást végzünk további glukagonkristályok nyerése céljából. A két részletből származó glukagonkristályokat (1. termékrészlet), valamint az első kristályosításból származó, pH 5,0-nél kapott csapadékok újrafeldolgozásával kapott kristályokat (2. termékrészlet) 3 perces centrifugálással összegyűjtjük, az anyalúgtól elválasztjuk, hideg vízben szuszpendálva liofilizáló készülék tartályba visszük át és gyorshűtéses fagyasztással szárítjuk. A közbenső kristályosításból származó glukagonkristályok 6
