176225. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glükagon kinyerésére az inzulin-előállítás során alkalmazott lúgos kristályosítás során keletkezett felülúszóból
7 176225 jznak általában a vízoldható ammóniumsók, lifémek és alkáliföldfémek — beleértve a perió« rendszer 6. periódusának megfelelő elemeit berts C. Weast, Ed.-in-Chief, „Handbook of mistry and Physics”, 53rd,Edition, The Chemi- Rubber Co., Qeveland, Ohio, 1972, p. B3) — vizató sói. Ilyen sók egyebek mellett az ammóniaromid, ammónium-klorid, ammónium-fluorid, nónium-jodid, ammónium-magnézium-szulfát, íónium-nitrát, ammónium-szulnít, lítium-bro, lítium-klorid, lítium-fluoroszilikát, lítium-fluordfonát, lítium-jodid, lítium-molibdát, lítium-nitlitium-kálium-szulfát, nátrium-ammónium-fosznátrium-ammónium-szulfát, nátrium-bromid, ium-klorid, nátrium-jodid, nátrium-hexafluorofát, nátrium-fluoroszulfonát, nátrium-magnéziszulfát, nátrium-nitrát, nátrium-hexametafoszfát, ium-dihidrogén-ortofoszfát, nátrium-monohidroortofoszfát, nátrium-szulfát, nátrium-hidrogénlfát, kálium-bromid, kálium-kalcium-bromid, káí-ldorid, kálium-fluorid, káhum-jodid, káliumgnézium-klorid-szulfát, kálium-magnézium-szulkálium-magnézium-klorid, kálium-molibdát, káí-ortofoszfát, kálium-nátrium-szulfát, rubídiumunid, rubídium-klorid, rubídium-fluorid, rubídijodid, rubídium-nitrát, cézium-bromid, céziumrid, cézium-fluorid, cézium-jodid, cézium-nitrát, um-szulfát, beríllium-bromid, berilUum-klorid, Jlium-fluorid, berillium-nitrát, berillium-ortofoszmagnézium-bromid, magnézium-kíorid, magnézi■jodid, magnézium-nitrát, magnézium-szilikofluokalcium-bromid, kalcium-klorid, kalcium-jodid, num-nitrát, stroncium-bromid, strondum-klorid, »ncium-jodid, bárium-bromid, bárium-jodid, ezek jldható hidrátjai és hasonlók. Előnyben részesítaz ammóniumsókat, közülük leginkább az amnium-szulfátot. Az alkalmas szervetlen sók áltaan körülbelül 0,5 mól koncentrációig használha. Előnyös koncentrációjuk mintegy 0,01— ,05 mól. A glukagon-szálképződés hőmérséklettartománya -30 °C. Az előnyös hőmérséklettartomány kőjelül 24—26 °C. A legelőnyösebb hőmérséklet °C. A szálképződés — melyet rázással segítünk — általában a savas vizes glukagonoldat elkészí- 3 utáni 3-4 órán belül megkezdődik és 48 óra tt befejeződik. 48 óránál hosszabb időre általáí nincs szükség. A szálképződés megtörténte után a glukagon-száat bármilyen ismert módszerrel összegyűjtjük, szűréssel vagy centrifugálással, az utóbbi elját részesítjük előnyben. Szükség esetén a glukai-szálakat moshatjuk, szervetlen sót tartalmazó y nem tartalmazó vizes savas közegben való iszpendálás útján. A mosófolyadék hőmérséklete -30 °C, előnyösen 25 °C. Ezután a szálakat az bbiek szerint összegyűjtjük és hidegen tartjuk, ikásosan 10 °C alatt, ha a következő lépést nem jtjuk azonnal végre. Szükség esetén kelátképző vegyületet, mint etii-diamin-tetraecetsavat is adhatunk a szálképző zeghez. A kelátképző vegyidet koncentrációja szososan 0,01 mól alatt van, az előnyös koncentrá> 0,004 mól. Mégis a kelátképző vegyületet elő-O O nyösen csak cink vagy más kétértékű fémion jelenléte esetén alkalmazzuk. Mint említettük, a 2. lépésben kapott glukagont előnyösen kristályosítás útján tisztítjuk. Általában a glukagon kristályosítását úgy hajtjuk végre, hogy a glukagont lúgos vizes közegben oldjuk és gyengén lúgos vagy savas pH-ig megsavanyítjuk - pH 4,5-8,5-ig - a kristályosodás megindítása céljából. A glukagont kétféleképpen oldhatjuk fel, éspedig közvetlenül lúgos vizes közegben, vagy először desztillált vízben szuszpendáljuk és a pH-t bázis segítségével állítjuk be. Alkalmas bázisok az alkálifém- és ammónium-hidroxidok, melyek közül a kálium-hidroxidot részesítjük előnyben. A kapott glukagonoldat pH-ja általában 9,0- -11,5, az előnyös pH-tartomány 9,5-10,5. A glukagon koncentrációja a lúgos oldatban körülbelül 2—10mg/ml. Az előnyös koncentráció-tartomány körülbelül 4—8 mg/ml, a legelőnyösebb koncentráció mintegy 5 mg/ml. Mivel a megsavanyítás gyakran kevés nem-glukagon fehéije kicsapódását eredményezi, ezért — bár ez nem alapvető - a következő megsavanyítási eljárást részesítjük előnyben. A lúgos glukagonoldatot körülbelül 55- —65 °C-ra melegítjük. Az oldatot ezután pH 4—6-ig megsavanyítjuk 10%-os foszforsavval. Bár az előző lépésnél alkalmazott savak bármelyike használható, a foszforsavat részesítjük előnyben. A kapott oldatot ezután a kezdeti magas hőmérsékleten feszüljük. Általában a szűrés nem kötelező és gyakran mellőzzük, ha a megsavanyítás után csak kevés csapadék képződik. Ezenfelül szükség esetén szűrésen kívül más módszerek is használhatók, így példáid centrifugálás. Ha a glukagonoldat színes, derítő szenet adhatunk hozzá a megsavanyítás előtt vagy után, előnyösen előtte. Megsavanyítás (és adott esetben szűrés) után a glukagonoldatot állni hagyjuk körülbelül 2—10 °C-on, előnyösen 4°C-on. A kristályosodás ideje körülbelül 24—120 óra, előnyösen körülbelül 72— —120 óra, legelőnyösebben 72 óra. A képződött glukagonkristályokról a felülúszó nagyrészét dekantáljuk, szokásosan szűrőt használva. A maradék felülúszót a kristályokról centrifugálással távölítjuk el. A tiszta glukagont ezután egymás után híg sóoldattal (szokásosan 0,001%) és vízzel mossuk. Utána a glukagont liofilizáljuk és hidegben tároljuk. A 2. lépésben kapott glukagon tisztaságától és a végső tisztított glukagon megkívánt tisztaságától függően egy vagy több további kristályosítást végezhetünk. Mégis azt találtuk, hogy összesen két kristályosítás elegendő legalább 80% tisztaságú glukagon előállításához. Ha két kristályosítást végzünk, a következő eljárást részesítjük előnyben: az első kristályosítást a fentiek szerint hajtjuk végre és a kristályokat lúgoldatban oldjuk. A második kristályosításhoz az oldatot körülbelül pH 7,0—8,5-ig, előnyösen körülbelül 7,3-7,5-ig, legelőnyösebben körülbelül 7,4-ig megsavanyítjuk. Az oldást és — adott esetben — a szűrést előnyösen mintegy 35—45 °C-on, legelőnyö5 10 15 £0 25 30 35 40 45 50 55 60 65
