176180. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antigénkészítmények előállítására
9 176180 10 4. példa 3. példa szerinti etanol-liposzómákat elkeverünk azonos térfogatú influenza-vírus X31 szubegységekkel (250 pg/ml) és a keveréket enyhén szonikáljuk. A kapott antigén készítményt egereken vizsgáljuk védőhatás szempontjából, az 1 .C) példa szerint. Az eredményeket a II. táblázat foglalja össze: 5. példa Parenterális oldat Lecitin/dicetilfoszfát (9 :1 térfogatarányban) 1 mg influenza-vírus X31 protein szubegységek nátriummértiolát foszfáttal pufferolt 3? a? o o nátriumklorid-oldat (pH = 7,2) 0,2 ml A foszfáttal pufferolt nátriumklorid-oldat összetétele: nátriumklorid 10 g/liter káliumklorid 0,25 g/liter káliumdihidrogénfoszfát 0,25 g/liter dinátriumhidrogénfoszfát 1,4375 g/liter 6. példa Inaktivált diftéria toxint tartalmazó liposzómák A) A liposzómák előállítása 3 mg dicetilfoszfátot és 27 mg lecitint feloldunk 4 ml kloroformban és az oldatot keverjük, majd hozzáadunk 3 ml foszfáttal pufferolt nátriumklorid-oldatot (PBS) és a kapott keveréket tartalmazó lombikot hozzákapcsoljuk egy Buchi rotációs elpárologtatóhoz. A vizes és nem-vizes fázisokat mágneses keveréssel és rotációs mozgással 1 órán keresztül keverjük enyhe vákuumban (100 Hgmm), 20 °C hőmérsékleten. A kloroformot ezután, a vákuumot növelve, eltávolítjuk. A kapott liposzóma-készítményt ezután 3 óra hosszat hagyjuk egyensúlyba kerülni. 0,3 ml inaktivált diftéria toxint (9 mg/ml) (Wellcome Laboratories) adunk a készítményhez, és a kapott keveréket ismét fél órán keresztül keverjük, a liposzóma ilyenkor a felületére felveszi az inaktivált diftéria toxint. A fölösleges inaktivált toxint 40 000 g-n 5 °C hőmérsékleten végzett 2 órás centrifugálással eltávolítjuk és a kapott liposzómákat 3 ml foszfáttal pufferolt nátriumklorid-oldatban újból szuszpendáljuk. [1. Biochim. Biophys. Acta, 266, 322 (1972).] B) Az inaktivált Diftéria toxint tartalmazó liposzómák hatása az egerek immun-reakciójára 5-12 CBA és Porton albino hím egerekből álló csoportok tagjainak hátát szubkután injekciózzuk változó adagú inaktivált diftéria toxinnal, vagy hasonló adagú inaktivált diftéria toxint tartalmazó liposzómákkal, 1 térfogat/súly% lipoid-koncentrációnál. Mindegyik kísérletnél a negatív kontroll egy csoport be-nem-injekciózott egér. Az állatoktól 21 nap múlva vért veszünk és a szérumot abszorbeáljuk, hogy elkülönítsük a juh-vörös-vérsejtek- és oí2 -makroglobulin antitesteit. A szérumot ezután hemagglutinációs vizsgálatoknak vetjük alá, inaktivált diftéria toxinnal szenzitivizált juh-vörös-vérsejteket alkalmazva [1. J. Immunoi. 100, No.2. 274 (1968)]. A hemagglutinációs titert tekintjük azon szérum-hígításnak, amely határozott agglutinációt mutat. Mindegyik vizsgálatnál pozitív kontrollként standard ló-antidiftéria, szérumot, negatív kontrollként pedig szérum nélküli szenzitivizált sejteket alkalmazunk. A be-neminjekciózott kontroli-csoport minden esetben negatív eredményt mutat. Az eredményeket mindegyik csoportnál az összes állat hemagglutinációs titere reciprokának az átlagában fejezzük ki és a III. és IV. táblázatban foglaltuk össze. III. Táblázat 5 CBA hím egérből álló csoport szérumának hemagglutinációs vizsgálata, az inaktivált diftéria toxin- vagy inaktivált diftéria toxint tartalmazó liposzóma-szubkután-injekciót követő 21 nap múlva Inaktivált Hemagglutinációs titer reciproka diftéria Inaktivált toxin Negatív Csak diftéria koncentkontroll inaktivált toxint rációja diftéria tartalmazó pg-ban toxin liposzómák 0 <2-7,5 <2 12,8 5,0 8,0 32 10,0 20,8 64 IV. Táblázat Porton albino hím egérből álló csoport szérűmának hemagglutinációs vizsgálata, az inaktivált diftéria toxin- vagy inaktivált diftéria toxint tartalmazó líposzóma-szubkután-injekciót követő 21 nap múlva vért veszünk Inaktivált Hemagglutinációs titer reciproka diftéria Inaktivált toxin Negatív Csak diftéria koncentkontroll inaktivált toxint rációja diftéria tartalmazó pg-ban toxin liposzómák 0 <2--8 — <2 11,3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
