176142. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tisztított albumin kinyerésére vérplazmából
5 176142 6 szárítjuk. Desztillált vízben újból feloldjuk, 0,04 M kaprilsav-oldatot adunk hozzá és a pH értékét 7,0 ± 0,4- re állítjuk be, az oldatot palackokba töltjük és 10 órán át 60 °C-on hőkezeljük. Ezután az oldat gyógyászati célokra felhasználható. A nagy molekulasúlyú anyagok mennyisége, azaz a 200000 feletti molekulasúlyú frakció mennyisége kevesebb, mint a teljes fehérjetartalom 0,1 %-a. A termelés albuminból körülbelül 90%, a vérplazma albumintartalmára vonatkoztatva. A poliakrilamid-elektroforézissel végzett vizsgálat szerint az albumin tisztasága 99,5% felett van. Összehasonlító vizsgálatok Az alábbi vizsgálatokat végeztük a találmány szerinti eljárás, valamint két ismert eljárás (3 415 804 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban szereplő PEG-kicsapás és a 134425 számú dán szabadalmi leírásban ismertetett termokoagulációs módszer) termékeinek összehasonlítására. 1. Az albumin elkülönítése a humán vérplazmából PEG-eljárással 1000 ml citráttal stabilizált humán vérplazmát 1370 ml 33% polietilénglikol 3000-t tartalmazó vizes oldattal elegyítünk és így 19%-os PEG-oldatot nyerünk. A pH-értékét 6,7 ±0,l-re állítjuk. A keveréket 45 percig állni hagyjuk, majd centrifugáljuk. A precipitátum fibrinogént és globulint tartalmaz, amíg az albumin a szupernatánsban marad. Az albumintartalmú szupernatánshoz annyi ecetsavat adunk, hogy annak pH-ja 5,0 és 4,8 között legyen. A keletkező albumintartalmú precipitátumot kicentrifugáljuk. Az albumint 800 ml desztillált vízben feloldjuk és szűrjük. A leszűrt oldatot hideg etanolban kicsapjuk (40% etanol, -5 °C, pH=4,8). A precipitálódott albumint kicentrifugáljuk, majd fagyasztva szárítjuk. Ezután az albumint desztillált vízben feloldjuk, 0,04 M kaprilsavval pH-ját 7,0 ±0,4-re állítjuk, majd palackozzuk és 10 órán át 60 °C-on hőkezeljük. 2. Az albumin előállítása humán vérplazmából termokoagulációs módszerrel (kaprilsav stabilizáló jelenlétében) 1000 ml citráttal stabilizált humán vérplazmához 2 ml kaprilsavat adunk. A pH-értékét 1 M NaOH vizes oldatával 4,8 ±0,1-re állítjuk. Az oldatot 30 percig 60 ±0,5 °C-on tartjuk. A keletkező precipitátumot kicentrifugáljuk. A centrifugált oldatot hideg etanollal kicsapjuk (40% etanol, -5 °C, pH=4,8). A precipitálódott albumint kicentrifugáljuk, majd fagyasztva szárítjuk. Ezután desztillált vízben feloldjuk, 0,04 M kaprilsavval a pH-ját 7,0±0,4-re állítjuk, palackozzuk és 10 órán át 60 °C-on hőkezeljük. 3. Kereskedelmi forgalomban kapható humán albumin Cohn-féle eljárás alapján (forgalmazó: Cutter. USA). 5 4. Albumín előállítása a találmány szerinti eljárással (lásd a példában) Fenti készítményekkel összehasonlító vizsgálatokat 10 végeztünk az aggregátumok (makromolekulák) nicnynyiségének meghatározása céljából. A vizsgálatokat „Sephadex(R) G 150"-cn analitikai gélliltrációs módszerrel végeztük, egy olyan pulfer alkalmazásával, amely 1000 ml-re 1,5 g kálium-foszfátot (analitikai minőség), 15 3,4 g nátrium-foszfátot (analitikai minőség) és 8.8 g nátrium-kloridot tartalmaz desztillált vízben oldva. A következő eredményeket kaptuk: Aggregátum mennyisége l. készítmény (PEG-kicsapás) kb. 5% 20 2. készítmény (termokoagulációs) kh. 1,5% 3. készítmény (Cohn-féle eljárás) kb. 2% 4. készítmény (találmány szerinti) 0.1% alatt A fenti eredményekből világosan látható, hogy a találmány szerinti eljárással állítható elő a legtisztább 25 termék, ugyanakkor a többi eljárás, különösen a PEG- kicsapás rosszabb minőségű terméket szolgáltat. HUMAN toleranciavizsgálatok: 200 mg/ml (20%) koncentrációjú, találmány szerinti készítmény, 100 ml per 2 perc adagolási sebesség mellett allergiás reakciókat nem okoz, a vérnyomást, pulzusszámot és testhőmérsékletet nem befolyásolja. Szabadalmi igénypontok 40 1. Eljárás tisztított albumin kinyerésére vérplazmából a vérplazma frakcionált kicsapása, a kapott albumintartalmú frakció vizes oldása és a vizes oldat kaprilsav stabilizálószer jelenlétében végzett termokoagulá- 45 iása útján, azzal jellemezve, hogy a vérplazmát polietilénglikollal elegyítjük és a savasságot 6—7 közötti pH- értékre állítjuk be, majd a kivált fibrinogén és globulinok feletti, 150—300 g/l, célszerűen 180—200 g/1 polictilcnglikolt tartalmazó folyadék savasságát 4,5—5,3 50 közötti pH-értékre állítjuk be, s a kivált, polietilénglikolt tartalmazó albumim vizes közegben feloldjuk, majd a nyert oldat termokoagulálását 50—65 cC-on és 4,6—5,0 közötti pH-értéken hajtjuk végre, végül a tisztított albumint kicsapással különítjük el az oldatból. 55 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a kaprilsav stabilizálószert 2—3 g/l mennyiségben alkalmazzuk. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a tisztított albumin ki- 60 csapását az albuminoldatnak kis szénatomszámú alkanollal, célszerűen etanollal történő elegyítésével végezzük. A kiadáséit felel: a Közgazdasági ét Jogi Könyvkiadó igazgatója 81.931 .£ó-42 Alföldi Nyomda, Debrecen — Felelőt vezető : Benkő István igazgató 3
