176103. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nembramicin-komplex előállítására mikrobiológiai úton
7 176103 8 A táblázatból látható, hogy a nebramicin-2-t tartalmazó táptalajon növesztett mikroorganizmusok termelőképessége az első kezelést követően átlagosan 1,85- szorosra, a második kezelés után 3,1-szeresre emelkedett a kiindulási törzs termelőképességéhez viszonyítva. 5 A nebramicin-2-vel nem kezelt törzsek az első ultraibolya besugárzás után mindössze 2%-kal, a második besugárzás után 16%-kal több antibiotikumot szintetizáltak. Kitűnik a táblázatból az is, hogy a nebramicin-2- re rezisztens törzsekkel kapott antibiotikum-keverék 10 komponensaránya a nebramicin-2 és a nebramicin-5' javára változott. A legelőnyösebb tulajdonságokkal rendelkező MNG 169 jelű törzset további felhasználásig hűtve tároljuk. b) Nebramicin-2-re rezisztens Streptomyces tenebrarius (MNG 170) izolálása Megismételjük az la példában megadott eljárás szerint az UV-kezelést, izolálást és az izolált telepek 20 rázott tenyészetben kivitelezett minősítését. A legtöbb antibiotikum-komplexet a legelőnyösebb összetételben bioszintetizáló törzseket az la példában megadott összetételű és nullától 30 mg/ml-ig növekvő mennyiségű apramicin-2-t tartalmazó ferdeagarokra 25 oltjuk. Négy napon át 37 C° hőmérsékleten inkubáljuk a tenyészeteket, majd a legtöbb antibiotikumot tartalmazó ferdeagarról újra sorozatos átoltást végzünk. Négyszer megismételjük az inkubációt és a sorozatos átoltásokat, ezt követően vizsgáljuk a legtöbb nebramicin-2 jelenlétében növekvő és légmicéliumokat fejlesztő tenyészetek termelőképességét. A fermentációt az ld példában megadottak szerint végezzük. Kontrollként vizsgáljuk a nebramicin-2-vel nem kezelt, de ugyancsak ötször átoltott és növesztett törzs termelőképességét. A nebramicin-2-vel nem kezelt, illetve egy UV-keze- Iést követően nebramicin-2-t tartalmazó táptalajon ötször átoltott törzsek termelőképességét és a termelt 15 nebramicin-komplex összetételét a 2. táblázatban adjuk meg. A táblázat adataiból látható, hogy a nebramicin-2-vel végzett kezelés eredményeképpen a törzs termelőképessége 2,4-szeresére fokozódott és a termelt antibiotikum-komplex összetétele előnyösen változott. Az izolált törzsek közül egyet, melynek különösen nebramicin-2 termelése volt kiemelkedő, MNG 170 sorszámmal letétbe helyeztünk az Országos Közegészségügyi Intézet Nemzeti Törzsgyűjteményében. 2. táblázat A nebramicin-2 jelenlétében növekvő Streptomyces tenebrarius termelőképessége Kezelés módja A vizsgált telepek száma (db) Az öt legjobban termelő törzs átlagos termelőképessége* (íig/jnl) A termelt nebramicin-komplex átlagos komponens-összetétele Termelés a kiindulási törzs termelőképes-nebramicin-2 nebramicin-4 (%)** nebramicin-5' Kiindulási törzs (1. kontroll) 1 3020 57 26 17 100 Kezelés nélkül (2. kontroll) 28 2880 58 28 14 95,4 UV-besugárzott és apramicinnel egyszer kezelt törzsek 44 3925 65 10 25 130 UV-besugárzott és apramicinnel ötször kezelt törzsek 32 7350 71 5 24 243 * A biológiai értékmérést Bacillus subtilis ATCC 6633 mikroorganizmussal és az la példában leírt nebramicin-komplex standard anyagot használva végeztük. ** A komplex komponens-összetételét kvantitatív vékonyrétegkromatográfiát követő bioautográfiával határoztuk meg, az la példában leírt módon. c) Nebramicin-5'-re vagy nebramicin-6-ra rezisztens Streptomyces tenebrarius izolálása Az la példában megadott eljárást ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy nebramicin-2 helyett nebramicin-5'-t vagy nebramicin-6-ot használunk. Ilyen módon olyan törzsekhez jutunk, amelyek 25 mg/ml nebramicin-5' vagy nebramicin-6 jelenlétében erőteljesen nőnek és légmicéliumokat fejlesztenek. A legjobban termelő törzsek tenyészlevében átlagosan 1,35-szor több nebramkin-komplex halmozódik fel, mint a kiindulási törzs táptalajában. A bioszintetizált antibiotikum-komplex átlagos, bioautográfiával meghatározott összetétele: 56% nebramicia-2, 17% nebramicin-4 és 25% nebramicin-5'. A komplex körülbelül 1%-nyi mennyiségű más, biológiailag aktív vegyületeket tartalmaz. 50 d) Nebramicin-2 és nebramicíh-5' előállítása rázott lombikban Az la példában megadott módon izolált, nebramicin-2 jelenlétében növekvő, az la példában megadott táp- 55 talajon fenntartott Streptomyces tenebrarius MNG 169 törzzsel az alábbi összetételű, 500 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikokban sterilezett, 100 ml, csapvízzel készült táptalajt oltjuk : szójaliszt 3.0% kazein-hidrolizátum (10%-os) 5,0% ammóniumklorid 0,5% ammóniumnitrát 0,1% kalciumkarboaát 0,3% magnéziumszulfát 0,5% kobaltnitrát 0,001% 4
