176103. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nembramicin-komplex előállítására mikrobiológiai úton
3 176103 4 3000 jJLg/ml nebramicin-4 és nebramicin-5', továbbá 3200 tzg/ml nebramicin-2 jelenlétében nem növekszik, és az említett antibiotikumok további termelése leáll. A táptalajhoz adagolt, vagy a sejtek saját bioszintetikus folyamatai révén felépült és a táptalajba kiválasztott antibiotikumok tehát a fenti koncentráció-határokon felül gátolják saját további szintézisüket. Azt észleltük továbbá, hogy azokban a sejtekben, amelyeket nebramiçin-2 tartalmú táptalajon növesztve kísérleti úton nebramicin-2-re érzéketlenné tettünk, ez a koncentráció-határ előnyösen eltolódik, és a fermentáció során a táptalajban —■ meglepő módon — háromszor több nebramicin-2 és nebramicm-5' halmozódik fel. Különösen figyelemre méltó, hogy a nebramicin-2-re rezisztenssé tett törzsek nebramicin-5' termelése is jelentősen megnő annak ellenére, hogy a két vegyület között nincs közelebbi szerkezeti rokonság. Érdekes módon a nebramicin-5'-re, illetve a nebramicin-6-ra érzéketlenné tett törzsek esetében a nebramicin-2 és a nebramicin-5' termelés egyaránt növekszik. Fentiek alapján a találmány tárgya új eljárás nebramicin-komplex, nevezetesen nebramicin-2, nebramicm-5' és nebramicin-4 előállítására mikrobiológiai úton, Streptomyces tenebrarius törzs felhasználásával. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy egy nebramicm-komplexet bioszintetizáló Streptomyces tenebrarius törzset nebramicin-2-t vagy nebramicin-5'-t vagy nebramicin-6-ot tartalmazó táptalajon tenyésztünk, a 10 mg/ml és 30 mg/ml közötti mennyiségű nebramicin-2 és/vagy nebramicin-5' és/vagy nebramicin-6 jelenlétében növekvő, légmicéliumot fejlesztő és spórázó egyedeket elkülönítjük, az így kapott új, rezisztens törzseket, előnyösen az Országos Közegészségügyi Intézet Nemzeti Törzsgyűjteményében MNG 169 és MNG 170 sorszámmal letétbe helyezett mikroorganizmusokat süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között nitrogén- és szénforrást, szérvetlen sókat és növényi vagy állati eredetű zsírokat vagy olajokat tartalmazó táptalajon 30 C° és 42 C° közötti hőmérsékleten tenyésztjük, majd a tenyészetben felhalmozódó antibiotikumokat ismert módon elkülönítjük. A találmány értelmében a nebramicin-2, nebramicin-5' és nebramicin-4 előállítására célszerűen úgy járunk el, hogy a Streptomyces tenebrarius MNG 169 vagy MNG 170 számú, vagy a találmány szerinti eljárással előállított más, előnyösen nebramicin-2-re, nebramicin-5'-re és/vagy nebramicin-6-ra rezisztens törzs spóráival vagy vegetatív micéliumával szerves nitrogén- és szénforrást, továbbá szervetlen sókat tartalmazó táptalajt oltunk, majd megfelelő levegőcserét biztosítva 30 C° és 42 C° közötti, előnyösen 33—38 C° hőmérsékleten inkubáljuk a tenyészeteket. A fermentációt a 96—120. órában fejezzük be, ekkor a táptalaj 3000 fzg/ml és 6000 p.g/ml közötti mennyiségű nebramicin-2-t, 650 fzg/ml és 1500 fxg/ml közötti mennyiségű nebramicin-5'-t, továbbá 100—300 u.g/ml nebramicin-4- et és esetenként minor komponenseket tartalmaz. A nebramicin antibiotikum-keverék egyes összetevői jelenlétében erőteljesen növekvő és spórázó Streptomyces tenebrarius MNG 169 vagy MNG 170 tenyésztésekor szénforrásként előnyösen glükózt, keményítőt, glicerint vagy fruktózt és növényi vagy állati olajokat vagy zsírokat adunk a táptalajhoz. Nitrogénforrásként mogyorólisztet, kukoricalekvárt, peptoat, előnyösen szójalisztot, kazeint, aminosavakat és szervetlen ammóniumsókat használunk. Szervetlen sóként továbbá kalciumkarbonátot, magnéziumszulfátot és kobalt-sókat célszerű adni a táptalajhoz. A termelést előnyösen befolyásoló nyomelemeket a táptalaj többi összetevője szennyezőanyagként tartalmazza. A tenyésztést előnyösen 35 C° és 38 C° közötti hőmérsékleten 96—120 órán át végezzük. A tenyészeteken átáramoltatott levegő mennyiségét a táptalaj összetétele és a készülék műszaki adatai szerint kell megválasztani. Egy 1,1—1,4 mM 02 liter/pere szulfitoxidációs számmal jellemzett fermentoron előnyösen 1,0—-1,4 térfogatnyi levegőt vezetünk át percenként, egységnyi táptalaj-térfogatra számítva, miközben percenként 300—500-at forduló keverővei keverjük a táptalajt. A táptalajok sterilezését 30—60 percen át 121—123 C° hőmérsékleten gőzzel végezzük. A táptalajok pH-ját sterilezés előtt 7,2—7,4 közötti értékre célszerű beállítani. A fermentáció közben habzásgátlót nem kell adagolni, mivel a tápanyagforrásként adagolt növényi vagy állati zsírok vagy olajok egyúttal a tenyészlé habzását is gátolják. A találmány egy előnyös kivitelezési változata szerint a nebramicin-2-re rezisztens törzsek előállítására úgy járunk el, hogy a kiindulási törzs 7,0 pH-jú foszfát-pufferben szuszpendált spóráit, 10 másodpercenként mintát véve, 3 percen át ultraibolya fénnyel besugározzuk, és a mintákat megfelelő hígítás után növekvő mennyiségű nebramicin-2-t, nebramicin-5'-t vagy nebramicin-6-ot tartalmazó szilárd halmazállapotú táptalajokra szélesztjük. Négy napon át 37 C° hőmérsékleten inkubáljuk a tenyészeteket, majd a legtöbb antibiotikumot tartalmazó táptalajokon légmicéliumot és spórákat fejlesztő telepeket izoláljuk, és rázott tenyészetekben vizsgáljuk termelőképességüket és a termelt nebramicin-komplex kvantitatív komponens-összetételét. A legtöbb antibiotikumot a legelőnyösebb komponens-összetételben szintetizáló törzsekkel megismételjük az ultraibolya fénnyel való kezelést és az antibiotikumos táptalajon történő szélesztést, ami után legalább 20 mg/ml nebramiein-2, illetve nebramicin-6 (vagy nebramicin-5') jelenlétében is növekvő, légmicéliumot fejlesztő és spórázó telepeket kapunk. A találmány szerinti eljárás egy másik előnyös kivitelezési változata szerint a saját termékre rezisztens mikroorganizmusok előállítását úgy végezzük, hogy a Streptomyces tenebrarius spóráit ultraibolya fénnyel besugározzuk, majd a besugárzott spóraszuszpertztóból 10 másodpercenként vett mintákat megfelelő hígítás után növekvő mennyiségű nebramiein-2-t vagy nebramicin-6- ot tartalmazó szilárd halmazállapotú táptalajra szélesztjük. Négy napon át 37 C° hőmérsékleten inkubáljuk a tenyészeteket, majd a legtöbb antibiotikumot tartalmazó táptalajokon légmicéliumot és spórákat fejlesztő telepeket izoláljuk, és vizsgáljuk termelőképességüket. A legtöbb nebramicin-2-t és/vagy nebramicin-5'-t termelő törzseket növekvő mennyiségű nebramicin-2-t vagy nebramicin-6-ot tartalmazó ferdeagarokra oltjuk, majd 37 C° hőmérsékleten négy napon át inkubáljuk a tenyészeteket. Az antibiotikumot tartalmazó táptalajokra való átoltást négyszer megismételjük, ami után Í0 mg/ml és 30 mg/ml közötti mennyiségű nebramicin-2-re és tobramiein-6-ra (vagy nebramicin-5'-re) rezisztens variánsok hoz j utunk. ' Mindkét kivitelezési változat szerint eljárva olyan 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
