175972. lajstromszámú szabadalom • Új eljárás nagytisztaságú szérum-albumin előállítására
3 175972 4 rikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás). Ezen polimer anyagok használatának az az előnye, hogy szobahőmérsékleten dolgozhatunk velük, és így elkerülhetjük a Cohn-féle etanolos frakcionálási eljárás hidegen végzett műveleteinek nehézségeit. Ezekkel a különféle polimeres frakcionálási módszerekkel jól lehet plazma-protein-frakciót előállítani, azonban normál szérum-albumin-frakciót általában nem lehet így olyan jó termeléssel és minőségben előállítani, mint a hideg etanolos eljárással. Egy további, tisztított szérum-albumin előállítására szolgáló eljárás szerint kaprilát- vagy más zsírsav-anionok mint stabilizátorok jelenlétében szelektíven denaturálják a szérum-giobulínokat, anélkül, hogy eközben denaturálnák a szérum-albumint [2 705 230 számú és 2 765 299 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírások. J. Bioi. Chem. 162, 181-198 (1946), Blut 30, 121-134 (1975)]. Habár plazma-protein-frakeió típusú albumin-frakciók előállítására ez a módszer jól használható, általában nem lehet vele nagytisztaságú normál szérum-albumint jó termeléssel előállítani oly módon, hogy közben ne idéznénk elő az értékes y-globulinok bomlását. A gyakorlatban általában pasztörizálási műveletként hajtják végre az eljárást, és így vírusmentes albumint nyernek. A találmány értelmében plazmából, vagy más, albumin-tartalmú vérfrakciókból jó termeléssel állíthatunk elő nagytisztaságú szérum-albumin-frakciót oly módon, hogy a kiindulási oldatokat valamely, az albumint nagy mennyiségben adszorbeálni képes polimer gyantával kezeljük, majd 5,0 és 5,5-es pH-érték mellett 1—4 órán át 65—7f’°C hőmérsékleten tartjuk az elegyet, és végül 3,5 és 4,5-es pH-érték mellett szelektív módon eluáljuk az albumint a gyanta-fehérje elegyből. A találmány szerinti eljárás során alkalmazott polimer gyanták etilénből és maleinsav-anhidridből nyerhető, vízoldhatatlan, térhálós polielektrolit kopolimerek, amelyekhez dimetil-amino-propil-csoportok kapcsolódnak. A hőkezelés és az adszorpciós-elúciós művelet együttes alkalmazása révén lényegesen tisztábban és jobb termeléssel nyerjük az albumint, mint csak hőkezeléssel, vagy csak az adszorpciós-elúciós művelettel. A találmány értelmében teljes vérből, vérplazmából, szérumból vagy ezek közismerten albumint is tartalmazó frakcióiból állíthatunk elő szérum-albumint. Miután az itt alkalmazott hőkezelés során a hőkezelt anyagban levő globulinok részben denaturálódnak, gyakran célszerű a találmány szerintieljárás kivitelezése előtt bizonyos értékes globulin-frakciókat, például a y-globulinokat kinyerni. A találmány szerinti eljárás kivitelezése előtt ugyancsak kinyerhetünk már értékes vérfrakciókat, például véralvadási faktorokat, AHF-et és protrombin-komplexet a kiindulási anyagként használt plazmából. E frakciók elkülönítésére az ezen szakmában szokásos módszereket alkalmazhatjuk. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott vízoldhatatlan térhálós polielektrolit kopolimerek az etilén és a maleinsav-anhidrid kopolimetjei, amelyekhez dimetil-amino-propil-csoportok kapcsolódnak. Az etilénből és a maleinsav-anhidridből például oly módon állíthatjuk elő az alap-kopolimert (EMA), hogy valamely alkalmas oldószerben, peroxid-katalizátor jelenlétében reagáltatjuk a fenti két kiindulási anyagot. A kopolimer előnyösen lényegében ekvimoláris mennyiségben tartalmazza az etilén-egységeket és a maleinsav-anhidrid egységeket. Ezután a két primer aminocsoportot tartalmazó metil-imino-bisz-propil-aminnal reagáltatjuk az etilén-(maleinsav-anhidrid) alap-kopolimert, és ily módon térhálós etilén-(maleinsav-anhidrid)-kopolimert nyerünk. Erre a térhálós kopolimerre oly módon vihetjük rá a kívánt dimetil-amino-propil-csoportokat, hogy az etilén-(maleinsav-anhidrid)-kopolimer anhidridcsoportjait dimetil-amino-propil-aminnal reagáltatjuk. A jobb kezelhetőség érdekében célszerűen sósavas sójává alakíthatjuk át a polielektrolit kopolimert. A 3 554 985 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás további adatokat tartalmaz ezen polielektrolit kopolimerek előállításáról és szerkezetéről. A 3 555 001 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás pedig megadja, hogyan lehet ezen polielektrolit kopolimerekkel a vérből a plazma-protein frakciót nyerni. A találmány szerinti eljárásban előnyösen használható polielektrolit kopolimer az etilén-(maleinsav-anhidrid)-kopolimer minden ipo maleinsav-anhidrid-egységére számítva körülbelül 5-metil-imino-bisz-propil-amino-csoportot tartalmaz mint térhálósító keresztkötést, és körülbelül 90 dimetil-amino-propil-amino-csoportot, mint az alapvázhoz kapcsolódó funkciós csoportot. Meglepő módon azt találtuk, hogy a fent említett polielektrolit kopolimerek sokkal nagyobb mennyiségben képesek albumint megkötni, mint bizonyos más, ettől eltérő funkciós csoportokat viselő polielektrolit kopolimerek. így a fent említett polielektrolit kopolimer adszorbeálni tudja lényegében az összes, a vérben jelenlevő albumint. és a hőkezelés után végzett elúció útján ennek az albuminmennyiségnek több mint 90%-át 94%-osnál nagyobb tisztaságban ki lehet nyerni. Összehasonlításképpen: a 2-(amino-etil)-l-etil-pirrolidin-csoportokat mint funkciós csoportokat tartalmazó hasonló polielektrolit kopolimer a vérben jelenlevő összes albuminnak csak körülbelül 22%-át adszorbeálja, és hőkezelés után végzett elúció útján mindössze 67%-os tisztaságú anyagot lehet nyerni. Egy másik hasonló polielektrolit kopolimer, amelyhez 3-(di-n-butil-amino)-propil-amino-csoportok kapcsolódtak mint funkciós csoportok, megkötötte az albumin legnagyobb részét, de a hőkezelés után elúcióval egyáltalán nem lehetett albumint kinyerni róla. A találmány szerinti eljárás egyik előnyös kivitelezési változata szerint összekeverjük a fent említett polielektrolit kopolimereket vérplazmával, szérummal vagy albumint tartalmazó vérfrakciókkal, mégpedig 1% és 5% közötti mennyiségű kopolimert használunk. A polimer gyanta-protein elegy pH-ját különböző értékekre beállítva először kinyerhetünk bizonyos fehérjéket. 5,5 és 7,5 közötti pH-érték mellett a gyanta az albumint, az a- és (3-globulinokat és a fibrinogént adszorbeálja, a y-globulin legnagyobb részét viszont nem, és így ez utóbbit gyógyászati célokra kinyerhetjük a felülúszó folyadékból. így a frakcionálási folyamat első művele-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
