175526. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-amino-ciklopent-1-én- 1-ditiokarbonsav-diszulfidok előállítására
3 175526 4 min-ß-hidroxiläz gátlók az aromás és alkiltiokarbamid-származékok (Johnson et al: J. Pharm. Exptl. Ther. 171, 80., 1970.). A mikrobiális anyagok közül erős dopamin-ß-hidroxiláz gátló hatást mutat a fuzársav (5-butil-pikolinsav) és annak származékai (lásd pl. Hidaka et al: Molec. Pharmacol. 9., 172. 1973), valamint az oosponol (Umezawa et al: J. Antibiotics, 25., 239. 1972) és a dopastin (Iinuma et. al: J. Agr. Biol. Chem. 38., 2107, 1974.). A már ismert és forgalomban levő gyógyszerek némelyikéről is kimutatták utólag, hogy gátolja a dopamin-ß-hidroxiläzt, így pl. a hidralazinról, methimazolról, anfetaminról. A fenti vegyületek nagy részének közös hátránya, hogy bár a dopamin-ß-hidroxiläzt gátolják, különösen hosszabb kezelési idők esetén meglehetősen toxikusak, ezért a gyógyászatban nem vagy csak korlátozott mértékben alkalmazhatók. A találmány szerinti vegyületek erős dopamin-ß-hidroxiláz gátló hatást mutatnak, ezenkívül toxicitásuk kisebb, mint a hasonló hatású vegyületeké, így értékesen gazdagítják a technikát. A találmány szerinti vegyületek dopamin-ß-hidroxiláz-gátló hatását az alábbi kísérletekkel szemléltetjük. A kísérletekhez 150-200 g testsúlyú Wistar hím patkányokat használtunk. A vegyületek dopamin-ß-hidroxiláz gátló hatására az agy, szív, lép és mellékvese noradrenalin, dopamin és adrenalin szintjeinek változásaiból következtetünk. Meghatároztuk az agy szerotonin és 5-hidroxi-indolil-ecetsav szintjeit is. A meghatározásokat az alábbi módon végeztük. Az állatokat dekapitáltuk, az agyat, szivet, lépet és mellékveséket gyorsan eltávolítottuk és szárazjéggel hűtött fémlapra helyezve megfagyasztottuk. A megfagyasztott szerveket legfeljebb egy éjszakán át tároltuk -20 °C-on. Mellékvese adrenalin-tartalmának meghatározása. A mellékveséket a zsírtól megtisztítottuk és 3,0 ml 0,4 n jéghideg perklórsavban homogenizáltuk. A homogenizátumokat 10 percen át centrifugáltuk 0 °C hőmérsékleten 3200 fordulat/perc sebességgel Janetzky K-70 típusú centrifugán. A felüluszó folyadék 0,05 ml-éből Laverty és munkatársainak módszerével (Anal. Biochem. 22, 269. 1968) közvetlenül meghatároztuk az adrenalinszintet. Szív és lép noradrenalin-tartalmának meghatározása. Mindkét szervet fagyasztott állapotban történt súlymérés után 5,0 ml 0,4 n perklórsavban, amely 0,05% etiléndiamin-tetraecetsav-dinátriumsót és 0,1% nátriumtioszulfátot tartalmazott, homogenizáltuk, a felüluszókat leöntöttük, és a pH-t 0,1 mólos triszpufferrel (0,1 m trisz-puffer, amely 20 g nátriumhidroxidot és 25 g etiléndiamin-tetraecetsav-dinátriumsót tartalmazott Uterenként) 8,0 í 0,1 értékre állítottuk. A mintákhoz ezután 100 mg előkészített aluminiumoxidot adtunk (Anton et al: J.Pharm. Ther., 138, 360. 1962.) és az elegyet 20 percig mechanikusan ráztuk. Az aluminiumoxidot 2x10 ml desztillált vízzel mostuk, majd a noradrenalint 1,0 ml 0,05 n perldórsawal eluáltuk. A noradrenalin meghatározását az az eluátum 0,5 ml-éből végeztük a Schellenberger és munkatársai által leírt módon (Anal. Biochem. 39, 356, 1971), az alábbi módosításokkal. 0,5 ml eluátumhoz 0,5 ml 0,1 mólos Na-K-foszfát puffert adtunk (a puffer 9 g etiléndiamin-tetraecetsav-dinátriumsót tartalmazott literenként). A catecholaminokat (szívnél, lépnél csak noradrenalint, agynál - lásd később - noradrenalint és dopamint)0,l ml 0,1 n jóddal (5%-os káliumjodidban) oxidáltuk. Az oxidációt 0,25 ml 2,5%-os nátriumszulfittal (4,5 n nátriumhidroxidban oldva) állítottuk le pontosan 2 perc múlva. A lúgos szulfit-oldat hozzáadása után 2 perc múlva a mintákhoz 0,1 ml tömény ecetsavat adtunk (a pH-érték 4,4-4,5-re csökkent). A mintákat ezután 5 percre 100 °C-os szárítószekrénybe helyeztük, a melegítési idő letelte után jeges vízben lehűtöttük. A noradrenalin fluoreszcenciáját OPTON spektrofotofluorométerrel mértük 390 nm gerjesztési és 490 nm emissziós hullámhossznál. Agy noradrenalin- (NA), dopamin (DA), szerotonin- (SE) és 5-hidroxi-indolilecetsav-tartalmának (5- -HIAA) a meghatározása. Az agyakat 10 térfogatrész 0,4 n perklórsavban homogenizáltuk. A homogenizátumot éjszakán át -20 °C hőmérsékleten tároltuk, majd megolvasztottuk és a fenti módon centrifugáltuk. 0,5 g agynak megfelelő homogenizátum mennyiséget kivettünk, pH-ját 0,1 mólos fenti trisz-puffer kombinátummal 8,0 í 0,1-re beállítottuk. A továbbiakban ugyanúgy jártunk el, mint a szív és a lép noradrenaliri-tartalmának a meghatározásánál, azzal az eltéréssel, hogy az eluálást 1,5 ml 0,05 n perklórsawal végeztük, és az eluátum 0,5 miéből határoztuk meg a noradrenalin- és dopamin-tartalmat ugyanúgy, mint a szív és lép esetében, kivéve, hogy a NA fluoreszcenciájának leolvasásához 0 5 ml mintát használtunk. A maradékot 50 percre 100 6C-os szárítószekrénybe helyeztük. A melegítés után jeges vízben lehűtöttük és a DA fluoreszcenciáját 325 nm gerjesztési és 380 nm emissziós hullámhossznál olvastuk le. Olyan vizsgálatokat is végeztünk, amikor ugyanabból a mintából a noradrenalinon és dopaminon kívül a szerotonin és 5-hidroxi-indolilecetsav mennyiségét is meghatároztuk. Ekkor úgy jártunk el, hogy az agyakat 10 ml 75%-os etanolban homogenizáltuk, majd a homogenizátumokhoz 0,2 ml etüendiamin-tetraecetsav-dinátriumsó és 5% aszkorbinsav elegyét adtuk. A homogenizátumokat éjszakán át -20 °C hőmérsékleten tartottuk, majd a fenti módon centrifugáltuk. A felüluszó folyadékokból 5,0 ml-t kivettünk, azonos térfogatú desztillált vízzel felhígítottuk és pufferolt, 0,5x1,5 cm méretű Amberlite CG-30 (200400 mesh) ioncserélő oszlopokra töltöttük. Az átfolyás után az oszlopokat 5 nú desztillált vízzel, majd 1,0 ml 0,2 n sósavval mostuk. (Az átfolyó folyadékot és a desztillált vizes mosófolyadékot összegyűjtöttük az 5-hidroxi-iondolilecetsav meghatározásához.) A noradrenalint, dopamint és szerotonint további 1,2 ml 0,2 n sósavval eluáltuk. A meghatározásokat 0,3 ml eluátumból végeztük. A noradrenalin és dopamin meghatározását a Shellenberger és munkatársai által leírt, fentiekben hivatkozott módon és a szerotonin meghatározását a Curzon és munkatársai által leírt módszer (Brit. J. Pharmacol. 39., 653.1970.) általunk módosított változatával végeztük, az alábbi módon: 5 ml SE tartalmú mintához 0,6 ml 0,01%-os orto-ftál(di)aldehidet adtunk, (0,5%-os absz. etanolban oldott orto-ftál(di)aldehidet 50-szeresre hígítunk 10 n sósavval) amelyet közvetlenül használat előtt készítettünk. A mintákat ezután 10 percre forró vízfürdőbe helyeztük. A forró vízből való kivétel után a mintákat csapvízben lehűtöttük, majd a fluoreszcenciát 360 nm gerjesztési és 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
