175489. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vakcinák előállítására
3 175489 4 fugálják. A kapott mintákat formaiinnal inaktiválják, bakteriológiailag szűrik és a vakcinákat izolálják. Az ismert eljárások hátránya bonyolult technológia. Ezáltal a besűrítés és tisztítás pótlólagos műveletet igényel, mimellett a besűrítést adszorpció-elúció segítségével és a tisztítást gélszűrés segítségével végzik. E műveleti lépések során 50—90%-os vírusveszteség lép fel, továbbá a besűrítés és tisztítás után még sterilizálás is szükséges. Az elölt vírusokat tartalmazó vakcinák előállítása céljából végzett vegyi inaktiválás csökkenti a vírusok immunogenitását. E hatás kiegyenlítésére több vírusanyagot, azaz több fehérjét adagolnak be, ami viszont a szervezetben nemkívánatos mellékreakciókat idéz elő. Ezenkívül az ismert eljárások kivitelezéséhez bonyolult berendezésekre van szükség. Az 1 951 800 sz. Német Szövetségi Köztársaság-beli közrebocsátási irat rámutat arra, hogy rendkívül fontos a vírusvakcinák mellékhatásának kiküszöbölése, és javasolja, hogy erre a célra a vírusszuszpenziók tisztítása szabályozott porozitású üvegadszorbensen való kromatográfiával történjen. Az idézett antériorités a vakcinák tulajdonképpeni előállítását nem mutatja be, és magát a tisztítást is kiviteli példák nélkül, csak nagy vonalakban vázolja. Ilyen értelemben ez a publikáció mindössze problémafelvetés, a megoldásnak a reprodukáláshoz megkívánt részletességű ismertetése nélkül. Megkíséreltük az 1 951 000 sz. Német Szövetségi Köztársaság-beli közrebocsátási irat igen vázlatos eljárásának kivitelezését, és azt tapasztaltuk, hogy elérhető ugyan 88%-os tisztítás, azonban a vírusszuszpenzió a tisztítás során körülbelül kétszeresre hígul. Ez igen jelentős hátrány, mivel a vakcina tisztasága mellett a koncentrációja, azaz a rendelkezésre álló és viszonylag nem nagy térfogatban befecskendezhető antigénmennyiség sem mellékes. A találmány feladatául tűztük ki a technológiai folyamatok leegyszerűsítésével az apparativ felhasználás leegyszerűsítését és olyan, kellő töménységű, vakcinák előállítását, amelyek nem idéznek elő a szervezetben mellékreakciókat. A találmány szerint nem allergén, elölt vírusokat tartalmazó, legfeljebb 0,1 mg/ml fehérjetartalmú vakcinát állítunk elő bármilyen kiindulási víruskultűra, például A2 (Honkong) 68 vagy A2 (Viktória) 36/72 allantoisz-tenyészet tisztítása, betöményítése, izolálása és inaktiválása útján. A találmány szerinti eljárás során a vírustenyészet szuszpenzióját a) porózus, virionokat nem szorbeáló, 50- —10000 Â pórusátmérőjű szilikátanyaggal töltött oszlopon gélkromatográfiásan tisztítjuk és adszorpció-elúció útján 2—1000-szeresre betöményítjük, vagy b) adszorpció-elúció útján 2-1000-szeresre betöményítjük, porózus, a virionokat nem szorbeáló, 60-10000 Â pórusátmérőjű szilikátanyaggal töltött oszlopon gélkromatográfiásan tisztítjuk, vagy c) porózus, a virionokat nem szorbeáló, 50- —10000 Â pórusátmérőjű szilikátanyaggal töltött oszlopon gélkromatográfiásan tisztítjuk és egyidejűleg 2—1060-szeresre betöményítjük, végül a vírusszuszpenziót 7—7,8 közötti pH-értékű és 0,140-0,154 mól/liter nátriumkloridot tartalmazó pufféról dattal történő elúcióval elkülönítjük, és kívánt esetben az elkülönített vagy a kiindulási vírusszuszpenziót ultraibolya fénnyel vagy vegyi úton inaktiváljuk. Elölt vírusokat tartalmazó vakcinák előállításához az inaktiválást 5000-200 000 erg/cm2 dózisú ibolyántúli fénnyel vagy 5%-os formalinoldattal végezhetjük. Az adszorpció-elúció útján való betöményítést előnyösen oszlopban végezzük, melynek töltete porózus szilikátanyag, majd a deszorpciót 6-10pH-jú és 0,1—1,0 ionerősségű pufferoldattal hajtjuk végre. Célszerűen 6-8,2 pH-jú foszfátpuffert vagy 7,2-10,0 pH-jú és 0,1-1,0 ionerősségű triszpuffert alkalmazunk. (pH = 6,0 értéket biztosít például 12.3 M dinátriumhidrogénfoszfát, és 100 ml víz elegye. 94,7 ml 0,2 M dinátriumhidrogénfoszfát és 5.3 ml 0,2 mól nátriumdihidrogénfoszfát és 100 ml víz elegye pedig pH = 8,2 értéket szolgáltat.) Porózus szilikátanyagként előnyösen nátrium-boroszilikát-üveget vagy nagypórusú, 0,1—0,3 mm szemcseméretű és 300—2000 À pórusátmérőjű továbbá 0,3—2,5 cm3/g porozitású kovasavgélt alkalmazunk. Az adszorpció-elúció segítségével történő besűrítést végezhetjük formáimnál kezelt eritrociton is. A vírusszuszpenzió izolálását fiziológiás körülmények mellett — pH-érték 7—7,8 nátriumklorid-koncentráció 0,14-0,154 mól/liter - végezzük. A vírusszuszpenzió izolálását fiziológiás körülmények mellett végezhetjük gélkromatográfia segítségével oszlopon, melynek töltete 50-10000 Â pórusátmérőjű szilikátanyag. Porózus szilikátanyagként célszerűen nátrium-boroszilikátüveget vagy 0,1 - —0,3 mm részecskeméretű, 300-2000 Â pórusátmérőjű és 0,3-2,5 cm3 lg porozitású kovasavgélt használunk. A találmány szerinti eljáráshoz előnyösen az A2 Honkong (1) 68 (amely a Moszkvai Ivanovszkij Virológiái Intézetben 0617 számon lett deponálva), a B/USSR/018/74 (amely a Moszkvai Ivanovszkij Virológiái Intézetben 1603 számon lett deponálva) és az A2 Viktória (3/75) amely a Moszkvai Ivanovszkij Virológiái Intézetben 2587 számon lett deponálva) vírustörzsek szuszpenzióját alkalmazzuk. A találmány szerinti eljárást az alábbiak szerint valósítjuk meg. A víruskultúra-szuszpenziót gélkromatográfia útján tisztítjuk. Ezt oly módon végezzük, hogy a vírusszuszpenziót porózus, a vírusokat nem szorbeáló, 50—10000 Â pórusátmérőjű szilikátanyaggal töltött oszlopba visszük. A folyamatot célszerűen nátrium-boroszilikátüvegen vagy nagypórusú, 0,1- -0,3 mm szemcseméretű és 300-2000 Â pórusátmérőjű valamint 0,3—2,5 cm3/g porozitású kovasavgélen végezzük. A felsorolt porózus szilikátanyagok a tág pórusmérettartománynál fogva lehetővé teszik, hogy a víruskészítmény nemcsak a kismolekulájú, hanem a nagymolekulájú szennyeződésektől is mentes le5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
