175339. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az MM 17880 jelű ß-laktám-antibiotikum gyógyászatilag elfogadható dibázisos sóinak előállítására
5 17S339 6 pufferolt elektrolitok vizes oldatai bizonyultak alkalmasnak valamely poláris hordozóanyaggal, például lúgos ion-cserélő gyantával kombinálva az MM 17880 dibázisos sóinak tisztítására. Például egy szokásos puffer-oldattal, például egy foszfát-pufferrel közel 7-es pH-értékre beállított nátrium-klorid-oldat használata előnyös egy olyan hordozóval kombinálva, mely kvatemer ammóniumcsoportokat tartalmaz. Úgy találtuk, hogy a bázisos ion-cserélő cellulózok és a bázisos ion-cserélő, térhálós dextránok alkalmas hordozóanyagok, és hogy különösen előnyös hordozóanyag a QAE Sephadex A25 (ahol a Sephadex jegyzett védjegy). Az MM 17880 gyógyászatiig elfogadható dibázisos sóit úgy szabadíthatjuk meg a szervetlen sóktól és más szennyezésektől is, hogy az antibiotikumot egy olyan lipofú gyantán adszorbeáljuk, melyen a szervetlen sók nem adszorbeálódnak. Tapasztalataink szerint valamely pdisztirol-divinilbenzol kopolimer, így például az Amberlite XAD-4 különösen alkalmas erre a célra, és a kívánt antibiotikum az oszlopról vízzel vagy vizes alkanollal végzett eluálással távolítható el. A kapott oldatot bepárlással koncentrálva és liofilizálva, tisztább anyagot kapunk. Az MM 17880 sóit a szervetlen sóktól úgy is elkülöníthetjük, hogy egy gél szűrő szerből, például térhálós dextrán gélekből, úgy mint Sephadex G15-ből vagy poliakrilamid gélekből, úgy mint Giogel P2 álló oszlopon kromatografáljuk. Az MM 17880 dibázisos sóit egy további lépésben úgy lehet megtisztítani az előző lépések során keletkezett anyagoktól, hogy egy inert szilárd kromatográfiás oszlopon kromatografáljuk, amely lehet szilikagél vagy cellulóz, vizes/alkoholos oldószer rendszereket használva. Alkalmas oldószerrendszerek azok, amelyek vizet és legalább egy kis szénatomszámú alkanolt tartalmaznak, például víz/izopropanol, víz/n-propanol, víz/metanol/izopropanol, víz/butanol, víz/etanol/butanol és más hasonló oldószerrendszerek. Különösen alkalmas oldószerrendszemek találtuk az n-propanol -víz 4:1 arányú elegy ét, cellulóz hordozóanyag felhasználása esetén. A fenti kezelés után összegyűjtött és megtartott frakciók a 3. ábrán bemutatott ultraibolya spektrumhoz hasonló spektrumot adnak és abszorpciós maximumuk körülbelül 297 nm-nél van, ami az MM 17880-ra jellemző. A kapott oldatok liofilizálásával lényegében tiszta, tehát 50%-ot elérő tisztaságú MM 17880 sót kapunk. A fentiek szerint a találmány eljárást nyújt az MM 17880 gyógyászatilag elfogadható dibázisos sóinak legalább 50%-os tisztaságban történő előállítására, melynek során az MM 17880 sóit további antibakteriális anyagokkal együtt tartalmazó oldatból az MM 17880 sóit egy lényegében csak ezeket a vegyületeket tartalmazó frakcióba gyűjtjük össze kromatográfiás eljárással és a legalább 5C?%-os tisztaságú dibázisos sókat elkülönítjük az oldatból. 1. példa Legalább 75%-os tisztaságú MM 17880-nátriumsó előállítása a) Fermentáció A Streptomyces otivaceus ATCC 31126 baktériumtörzset hét napon át 28 °C-on szilárd ferde agar tenyészetben, Roux palackban tenyésztjük. Az agar táptalaj összetétele a következő: 5 összetevő: élesztőkivonat glükóz-monohidrát agar csapvíz 10 Mennyiség (g/lit): 10,00 10,0 15,0 annyi, hogy a teljes térfogatot 1 literre egészítse ki 15 20 25 30 35 Kísérleteink során élesztőkivonatként „Yeatex” kivonatot használtunk, melyet a Bovril Food Ingredients, P.O. Box 18, Wellington Road, Burton-on-Trent forgalmaz, és az „Agar”-t az Oxoid Limited, Southwark Bridge Road, London W.E.I. szállítja. A táptalaj pH értékét sterilizálás előtt 6,8-ra állítjuk be. 7 nap után 50 ml, 0,02% Tween 80 (védjegy)at tartalmazó steril ionmentesített vizet adunk egy Roux palackhoz és a spórákat rázással szuszpendáljuk (a Tween 80 polioxietilén-szorbitán-monooleát, amely megközelítőleg 20 oxietilén egységet tartalmaz szorbitán egységenként). Ezt a spóraszuszpenziót ezután oltóanyagként 75 liter, sterilizált, beoltásra szolgáló táptalajhoz adjuk egy 100 literes rozsdamentes acélból készült fermentorban. A beoltásra szolgáló táptalaj összetétele a következő: összetevő: szójaliszt glükóz-monohidrát csapvíz Mennyiség (g/lit): 10,0 20,0 annyi, hogy a teljes térfogatot 1 literre egészítse ki Kísérleteink során Arkasoy 50 elnevezésű szójalisztet 40 használtunk, melyet a British Arkady Co. Ltd., Old Trafford, Manchester cég szállított részünkre. A habzás gátlása céljából 50 ml 10 térf.%-os Pheronic L81 (védjegy)-nek szójabab-olajjal készült elegyét adjuk a táptalajhoz sterilizálás előtt. (A Pheronic L81 45 védjegyű anyagot a Jacobsen van den Berg, UJC. Ltd., 231 The Vale, London W. 3. cég szállította számunkra.) A táptalajt a fermentorban 20 percen át, 120 °C- on gőzzel sterilizáljuk. A beoltásra szolgáló tenyészetet 140 fordulat/perc forgási sebességgel, egy 19,05 50 cm átmérőjű keverőlapáttal keveijük, és egy nyitott végű permetezőn keresztül 75 liter/perc mennyiségű, steril levegővel levegőztetjük. A tenyészetet tartalmazó edény terelőlemezekkel van ellátva. A hőmérsékletet 28 °C-ont tartjuk, és miután ilyen körülmények 55 között 45 órán keresztül végeztük az inkubálást, ennek a tenyészetnek 7,5 literét oltóanyagként 150 liter steril táptalajhoz adjuk, egy 300 liter térfogatú, rozsdamentes acélból készült fermentorban. A táptalaj összetétele a következő: 60 összetevő: szójabab-liszt (Arkasoy 50) glükóz-monohidrát kicsapott kalciumkarbonát 65 nátriumszulfát Mennyiség (g/lit): 10,0 20,0 0,2 10,0 3
