175265. lajstromszámú szabadalom • Eljárás N-acetil-tienamicin előállítására
13 175265 14 Ionac C—249 (gyárija a Ionac Chemical Co., Birmingham, New Jersey) és Amberlite 200. A kationcserélőről kapott N-acetil-tienamicin antibiotikumot kívánt esetben tovább tisztíthatjuk más módszerekkel. A tienamicin maga az aktív kationcserélő gyantán marad adszorbeálva. Ennek megfelelően a két vegyületet könnyen elválaszthatjuk egymástól. Az elválasztási eljárás abból áll, hogy az N-acetil-tienamicint erős bázikus anioncserélő gyantára adszorbeáljuk. Ilyen bázikus anioncserélő gyanták például a sztirol-divinilbenzol alapú gyanták, például a klorid ciklusban levő polisztirol-kvatemer ammonium gyanta (Dowex 1 x 2), gyártja Dow Chemical Co.: Midland, Michigan. Az erősen bázikus anionos ioncserélők közé tartozik még a Duolite A-40, A-42, A-101, A-102 és A-114 (gyártja a Chemical Process Co., Redwood City California, Amberlite IRA-400, IRA-401, IRA-410 (gyártja a Rohm and Haas, Washington Square, Philadelphia 5 Pennsylvania). Az eluátumban levő N-acetil-tienamicin antibiotikumot tovább tisztíthatjuk, ha középerős polaritású akril-észter polimerrel, például XAD-7 vagy 8 vagy polisztirol apoláris, hidrofób térhálós divinil-polimerrel, például XAD-1, 2, és 4 előnyösen XAD-2-vel töltött oszlopon keresztül engedjük. (A XAD—1,2,4,7 és 8 polimereket a Rohm and Haas, Philadelphia 5, Pennsylvania gyártja). További módszer tisztított N-acetil-tienamicin előállítására, ha poliakrilamid-gélen gélszűrést végzünk, a szűrő pórusmérete kizárja az 1800—nál nagyobb molekulasúlyú molekulákat. Előnyösen Bio—Gel P—2-t (poliakrilamid) használunk (gyártja a Bio-Rad, Richmond, California). A tisztított N-acetil-tienamicin visszanyerésére előnyös módszer, ha az antibiotikum oldatát, így például a szűrt ferm ntlevet, melynek pH-ját 4—5 értékre állítottuk be, erős kation-szulfonát típusú nátrium-ion-ciklusban levő ioncserélő gyantán átáramoltatjuk (Dowex 50 x 2). Az összegyűjtött frakciókat tovább tisztíthatjuk, ha a következő kromatográfiás közegeket használjuk fel: polisztirol-trimetil-ammónium típusú anion-cserélő gyanta (Dowex 1 x 2 klorid-ciklusban), polimer adszorbensek (például XAD—2 polisztirol gyanta), Dowex 1 x4 kloridciklusban és gél-áteresztő gyanták (például Bio—Gel P-2, poliakrilamid-típusú gyanú). Az eluátumok bioaktivitását Staphylococcus aureus ATCC 6538P tesztorganizmus felhasználásával mértük, vagy ha a tisztaság megengedi, hidroxilamin kioltási abszorpcióval. Az N-acetil-tienamicin előállításának egy előnyös módját fermentléből az 5. táblázat szemlélteti. Az N-acetil-tienamicint tienamicin acetilezésével is előállíthatjuk. Az acetilezést acetil-halogeniddal, vagy előnyösen ecetsavanhidriddel hajthatjuk végre. A tienamicint alkalmas oldószerben, például dirnetilformamidban feloldjuk és az acetilezőszer feleslegével —10—25 °C-on, előnyösen 0°C körül kezeljük. A reakció körülbelül egy perc alatt befejeződik. 0°C-on mintegy 10 perc szükséges a reakció lejátszódásához. A tienamicin acetilezésével kapott nyers N-acetil-tienamicint az N-acetil-tienamicint tartalmazó szűrt fermentlé tisztításánál leírt módszenei tisztíthatjuk. Az acetilezéssel előállított N-acetil-tienamicin tisztítását előnyösen úgy végezzük, hogy a nyersanyagot anion cserélő klorid-ciklusban levő gyantára (például Dowex 1x4) adszorbeáltatjuk és vizes sóoldattal eluáljuk. Vizes sóoldatként előnyösen nátriumkloridot, ammónium-kloridot és ammóniát tartalmazó 0,07 M, 0,005 M és 0,0001 M koncetrációjú oldatot használunk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és besűrítjük. A koncentrátumot poliakrilamid gélen keresztül gélszűréssel tovább tisztíthatjuk. Előnyösen ionmentes vízzel eluált Bio—Gél P-2-t használunk gélként. A találmány szerinti eljárásokat a következő példákkal ábrázoljuk. A szakember számára azonban nyilvánvaló, hogy a találmány magában foglalja a funkcionálisan ekvi valens termékeket és eljárásváltozatokat is. Ezért tehát analóg eljárásnak kell tekinteni minden eljárás-módosítást, amely azonos termékekhez vezet. A leírt eljárásokat sokféleképpen változtathatjuk, de az eredetitől való eltérések a szakember számára nyilvánvalóak és ezért a találmány oltalmi körébe tartoznak. Az N-acetil-tienamicin antibiotikum elemzési módszerei I Biológiai elemzés Az antibiotikus aktivitást Vibrio percolans ATCC 8461 vagy Staphylococcus aureus ATCC 6538P teszt-organizmusok alkalmazásával a következőkben leírt lemez-diffúziós módszerrel határozzuk meg. A Vibrio percolans ATCC 8261 törzset tartalmazó tenyészeteket a következő módon állítjuk elő: Vibrio percolans ATCC 8461 liofilizált törzset tartalmazó tenyészetet 15 ml sterilizált 8 g/liter Difco fermentlevet és 2 g/liter élesztőextraktumot desztillált vízben tartalmazó közegben szuszpendálunk. A tenyészetet éjszaka rotációs rázóberendezésen 28 °C-on inkubáljuk. Ezzel a tenyészettel oltjuk be az 1,5%-os agar fenti összetételű fermentlével és élesztőextraktummal (a következőkben FLÉE) képezett elegyét tartalmazó ferde tenyészetek felületét, és a beoltott ferde tenyészeteket 28 °C-on inkubáljuk éjszaka és jégszekrényben tároljuk. Egyetlen liofilizált tenyészetből előállított hűtött ferde tenyészetet az elkészítéstől számított négy hétig használunk a következők szerint: A ferde tenyészetből egy csepp kristályt diszpergálunk egy 250 ml-es Erlenmeyer lombikban levő 50 ml FLÉE-ben. A tenyészetet az éjjelen keresztül rotációs rázókészülékben inkubáljuk 28 °C-on, majd olyan sűrűségűre hígítjuk, hogy 660 nm-nél az áteresztőképessége 50%-os legyen. A hígított tenyészet 33,2 ml-es adagját hozzáadjuk 1 liter 15 g agart tartalmazó FLÉE oldathoz és a hőmérsékletet 46 °C-on tartjuk. A beoltott agar-tartalmú közeget 100xl5mm-es műanyag Petri-csészékbe öntjük, edényenként 5 ml-t majd lehűtjük és használat előtt legfeljebb öt napig 2—4°C-on tartjuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
