175179. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pikolinsav-származékok előállítására
7 175179 8 bakkériumok és a sokostorosok (trichomonas) okozta fertőzések kezelésére lehet használni. A találmány szerint előállított vegyületek gyógyászati hatását a következőkben ismertetett vizsgálatokkal igazoljuk. A) In vitro vizsgálatok 1) A mikroorganizmus elkülönítése. A Corynebacterium acnes mikroorganizmust ügy kaptuk, hogy önkéntes, egészséges felnőttek orr-felületét enyhén összenyomtuk. A kisajtolt váladékot szív-agy agar táptalajra oltottuk és anaerob körülmények között 7 napig 37°C-on inkubáltuk. Hét nap múlva a táptalajt felülvizsgáltuk és a megfelelő telepeket vér-agarra oltottuk át, majd 28 óra hosszat anaerob körülmények között inkubáltuk. Az alkalmas 1 g telepeket gram-festéssel azonosítottuk. A Corynebacterium acnes-ként azonosított telepeket tioglikolát (10 % glicerin) táptalajra oltottuk. A telepeket 7 napig anaerób körülmények között inkubáltuk, majd a tenyészetet —4°C-on későbbi felhasználáshoz meg- 20 fagyasztottuk vagy szív-agy kivonatot tartalmazó táptalajra oltottuk közvetlen felhasználáshoz. Hét nap múlva a sejteket a szív-agy kivonat táptalajtól centrifugálással (10000/perc 30 percig 4 °C-on) elkülönítettük, a sejteket félretettük és a táptalajt felhasználtuk 25 az enzim előállítására. 2) Enzim-készítmény Adott térfogatú táptalajt keverés közben nagyon lassan hozzáadunk jeges acetonhoz (4°C) 1 tf. rész táptalajra számítva 1,5 tf. rész aceton mennyiségben. 30 A keveréket—4 °C-on fél óra hosszat tartottuk, majd Büchner-féle tölcséren papírszűrőn (Whatman No. 1) szűrtük. A csapadékot összegyűjtöttük és eredeti térfogata 1/5-ének megfelelő vízmennyiségben feloldottuk, majd liofilizálva a nyers enzimet por alakban 3g kaptuk. Az emzim-készítmény —4°C-on legalább 6 hónapig eltartható. 3) Zsírsvmentes pálmaolaj 10 ml pálmaolajat 10 ml vízmentes éterrel 250 ml választótölcsérben extraháltunk 10 ml, 10 %-os nát- 40 riumkarbonát-oldat jelenlétében. A keveréket alaposan összeráztuk, majd nyomásmentesítettük és ezután a rétegek szétválásáig állni hagytuk. Az alsó réteget félretettük, majd 4 ízben nátriumkarbonát-oldattal mostuk. Miután az alsó réteget félretettük, a kapott 45 oldatot lombikban forró vízfürdőn melegítettük az éter teljes eltávolításáig (2-3 óra). 0,1 g benzoesavat, 2,5 g arabmézgát és 90 ml meleg vizet kaptunk a mosott pálmaoljhoz és 1 percig nagysebességű homogenizálóval kevertük. A keverék 4 °C-on 6 hétig 50 eltartható. Vizsgálati eljárás (in vitro) Corynebacterium acnes lipáz (Előzetes vizsgálat) „ 0,15 ml, 50 mg/ml-es, félig tisztított bakteriális 0 enzimet (készült a fentiek szerint) 0,1 ml, 10 %-os zsírsavmentes pálmaolajjal reagáltatunk 2 ml térfogatban 7,0 pH( értéken (foszfátpuffer) és 37 °C-on. Három óra múlva 0,3 ml reakciókeveréket elveszünk a qq szabad zsírsav meghatározásához. Az enzimkészítmény aktivitását mikroekvivalens (/req) szabad zsírsav/literben adjuk meg. Staphylococcus aureus lipáz A vizsgálati körülmények megegyeznek az előzők- 55 ben ismertetettel azzal az eltéréssel, hogy az enzim koncentrációja 5 mg/ml. Módszer az in vitro bakteriális lipáz gátlásának meghatározására. A vizsgálati vegyületeket (5x10—4 mól-tói 5x10—8 mól koncentrációig) pufferolt oldatban inkubált lombikba helyezünk és a végső térfogat 2 ml. A vízben oldhatatlan vegyületeket először alkalmas oldószerrel (kloroform, dimetilszulfoxid) szolubilizáltuk, majd a felülúszó részt töltöttük a lombikba és az oldószert nitrogéngáz alatt elpárologtattuk, mielőtt az enzimet, a szubsztrátot és a puffert hozzáadtuk volna. Emzim nélküli kísérleteket is végeztünk, hogy megállapíthassuk a gyógyszernek a szabad zsírsavképződésre kifejtett hatását. A kísérleti körülmények és a szabad zsírsav meghatározása a fent ismertetett volt. A gátlást a következő módon számítottuk: Gátlás (%) = (lipáz aktivitás — hatóanyag lipáz aktivitása) x 100 lipáz aktivitás A vegyületek ICS0 értékének kiszámításához a legkisebb négyzetek módszerét alkalmaztuk a különböző moláris hatóanyag oldat koncentrációkkal elért 20-80 %-os gátlási értékek alapján. A Corynebacterium acnes lipáz in vitro gátlásának összehasonlító vizsgálata Vizsgálati körülmények: 0,15 ml, 50 mg/ml-es félig tisztított Corynebacterium acnes lipáz oldatot 0,15 ml pálmaolaj-szubsztráttal 2 ml-es össztérfogatban a vizsgálandó vegyülettel vagy anélkül 7 pH-értéken 3 óra hosszat 37°C-on reagáltattunk. A tetraciklinnel és a kontrollal véglett vizsgálatot 7,6 pH-értéken végeztük. Mindegyik koncentrációval 3 vizsgálatot végeztünk, és ezeket átlagoltuk. Az 5-trifenilmetil- píkolinsav vizsgált moláris koncentrációi: 3,6x10—4, 7,2x10—5, 3,6x10-s, 3,6x10—6, 7,2x10—7, l,2xl07. Az összehasonlításként használt tetraciklin moláris koncentrációja 4,5x10—4 és 3x10—4 volt. Az összehasonlításként használt hexaklorofén moláris koncetrációja 1x10—3 és 5x10—4 volt. Az IC5 0 értékeket adjuk meg, azaz azt a moláris koncentrációt, amely a szabad zsírsav keletkezését 50%-ban gátolja. Vegyület I C 5 0 (95%-os biztonsági határ) 5-trifenilmetil- 3,0 x 10-7mól(0,13 x 10-7- pikolinsav 44 x 10-7 mól) tetraciklin 3,1 x 10-4 mól(2,6 X10-4 -2,6 xlO-4 mól hexaklorofnn 7,5 x 10-4 mól(4,2 x 10-4 - -13,5 x 10-4mól) B) In vivo vizsgálatok Vizsgálati módszer Patkány bőrén Akut vizsgálat 5 vagy 10 fű vizsgálandó vegyületet dimetilszulfoxid vagy 1:1 arányú propilénglikol-etanol hordozóanyaggal érzéstelenített patkányok szőrtelenített hátbőrének különböző helyeire vittünk fel. Kontroll állatokat is alkalmaztunk, amelyek csak hordozó-, anyagot kaptak. Három óra múlva a bőrfelületet 4
