175176. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminoglikozid-tipusú g-52 antibiotikumot és sziszomicint tartalmazó komplek és összetevői előállítására
9 175176 10 Antibiotikumok Rt értékei, t = 16óra 2 -butanon .1erc-butanolmetanollömény ammóniumhidroxid, 16:3:1:6 0,73 0,59 0,75 0,65-, Rt = távolság a kiindulási ponttól t időpontban távolság a kiindulási pont és a papír vége között a) 0,95 mól nátriumszulfáttal és 0,05 mól nátriumhidrogénszulfáttal puff erőit papír. /a/ Carworth Farms CF-1 tipusu, 18-20 grammos egereket egy órával a fertőző mikroorganizmus halálos adagjának (107 mikroorganizmus) intraperitoneális beadása után egyetlen adag antibiotikum-szulfáttal kezeltünk. A fertőzés után 48 órával megállapítottuk a túlélők számát, és az adatokat standard probit műveletekkel elemezve 95 % megbízhatósággal megállapítottuk a PDS 0 értékeket. jbl A G-52 antibiotikum akut toxicitását szulfátsó alakjában szokásos módon határoztuk meg olyanképpen, hogy az egerekbe (CF-1) az antibiotikumot int ravénásan, szubkután és intraperitoneálisan adtuk be. Az eredményeket standard probit műveletekkel elemezve 95 % megbízhatósággal megállapítottuk az LDS0 értékeket. À következő példák a találmány szerinti eljárás legjobb végrehajtását szemléltetik. A hőmérsékleti adatokat Celsiusfokban közöljük. 1. példa Micromonospora zionensis NRRL 5466 fermentálása kádban A/ Első csíráztató szakasz 100-100 ml steril táptalajt (lásd alább az A táptalajt) tartalmazó 300 ml-es lombikok sarát-beoltjuk ferde agar tenyészetről vett egy kacsnyi Micromonospora zionensisszel. A lombikokat állandé keverés közben 2-4 napon át inkubáljuk, ho^y erőteljes növekedést érjünk el. Az inkubálást előnyösen percenként 250-300 fordulattal keverve, 35°-on végezzük. B/ Második csíráztató szakasz Az A/ szakasz szerint előállított 25-25 ml oltóanyagot 500-500 ml steril A táptalajt tartalmazó 2 literes Erlenmeyer-lombikok sorába be visszük, és a beoltott táptalajt az A/ szakaszban leírt módon keverés közben, előnyösen 28°-on, addig inkubáljuk, amíg erőteljes növekedést nem érünk el. C/ Fermentáló szakasz 20-20 liter fermentáló táptalajt (lásd alább a B táptalajt) tartalmazó 14 literes rermentáló kádsorba 500-500 ml csíráztatott tenyészetet viszünk be, és a keveréket percenként 200-500 fordulattal, előnyösen 400 fordulattal keverve, percenként 3-5 Qliter levegővel levegőztetve, 26-38°-on, előnyösen 35°-/on fermentáljuk. Az első 24 óra elteltével alkalmas időközökben meghatározzuk a fermentlé antibiotikumtartalmát, a fermentálást a hatékonyság csúcsértékének eléréséig folytatjuk, és az antibiotikum keveréket a 2. példa szerint feldolgozzuk. A közeg Szacharóz kukoricalekvár(porlasztva szárított ) élesztőkivonat N-zamin kalciumkarbonát csapvíz 25 35 40 B közeg 10 szójabab liszt 30 g burgonyadextrin 500 g glükóz 5 g Edamin (Sheffield Chemical Company) 5 g kalciumkarbonát 7 g vas/II/szulfát 10r3 r kobaltklorid IO-6 r csapvíz 1000 ml 20 2. példa 25 g 5g 5g 5g 5g 1000 ml Az antibiotikusan hatékony termék elkülönítése 60 liter fermentléhez 380 g oxálsavat adunk, és a pH-ját 6n kénsavval 2-re állítjuk be, majd 20 perces keverés után szűréssel elválasztjuk, a micéliumszűrőlepényt vízzel mossuk, és a víztiszta szüzedéket a micélium mosóvizével egyesítjük, és a pH-t 6n ammóniumhidroxid-oldattal beállítjuk 7 értékre. A szüredéket keverés közben 600-700 g Amberlite IRC-50 ammóniumfázisú kationcserélő gyantára öntjük, majd a gyantát szűréssel elválasztjuk. A gyantát vízzel mossuk, és 2n ammóniumhidroxid-oldattal eluáljuk. Az eluátumot 100 ml-re bepároljuk, és liofilizálva megkapjuk az antibiotikumkomplexet. Ezt a termácet kloroform, metanol és 17 %-os ammóniumhidroxidoldat 2:1:1 térfogatarányu keverékével papirkromatografálva kitűnik, hogy az lényegileg sziszomicinből és G-52 antibiotikumból áll, és titere 300 Mg/mg. 3. példa Az antibiotikusan hatékony termék szétválasztása Kloroform, izopropanol és tömény ammónium- 45 hidroxid-oldat 2:1:1 térfogatarányú keverékének alsó fázisában 1000 g kovasavgélt szuszpendálunk, és a szuszpenziót keverés közben 5 cm külső átmérőjű üvegoszlopba töltjük. A leülepedett kovasavgél magassága az oszlopban mintegy 100 cm. A 2. példa szerint 50 előállított antibiotikumkomplexből 12,4 g-ot vízben oldunk, és az oldatban 100 g kovasavgélt szuszpendálunk. Az antibiotikumkomplexet tartalmazó gyantát az oszlop tetejére töltjük, a fenti oldószerkeverék alsó fázisát percenként 1 ml sebességgel átfolyatjuk 55 az oszlopon, és 10 ml-es frakciókat szedünk. Mindegyik frakcióból két párhuzamos alikvot mintát veszünk, és kloroform, metanol és 17 %-os ammóniumhidroxid-oldat 2:1:1 térfogatarányu keverékével kromatografáljuk. A kívánt anyagot rendszerint 60 a 600. és 790. frakciók között találjuk. A kromatogramot ninhidrinnel permetezzük, hogy a ninhidrinpozitiv frakciók helyét láthatóvá tegyük. A második (párhuzamosan készült) kromatogramot Staphylococcus aureus ATCC 6538P mikroorganizmus 65 törzzsel beoltott agarlemezen bioautografáljuk, hogy megbizonyosodjunk a ninhidrin-pozitiv frakciók biológiai hatékonyságáról. 5
