175176. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminoglikozid-tipusú g-52 antibiotikumot és sziszomicint tartalmazó komplek és összetevői előállítására
5 175176 6 között való tenyésztésére addig, amíg a táptalaj jelentősen antibiotikusan hatékonnyá nem válik, majd legalább egy antibiotikusan hatékony frakciónak szabad alakban vagy farmakológiailag elfogadható savaddiciós só alakjában való elkülönítésére. A mikroorganizmus jelentős mennyiségű antibiotikumot termel, amikor vizes táptalajban süllyesztett aerób körülmények között tenyésztjük. Asszimilálható szénforrásként szénhidrátok, például a fent felsoroltak, különösen a glükóz, xilóz és szacharóz szolgálnak. Asszimilálható nitrogénforrások például a proteinek, aminosavak és az ezeket tartalmazó anyagok, például húskivonat, élesztőkivonat, szójababliszt stb. Ilyen nitrogénforrásokat a „Nitrogénhasznosítás,, című szakaszban soroltunk fel. Az előállítási példákban leírt fermentáló táptalajok és eljárások alkalmazásával jó növekedést és jó antibiotikumtermelést érhetünk el. Az antibiotikumtermelés fokozására a táptalajt nyomnyi mennyiségű szervetlen sók, például magnéziumszulfát, vas(II) szulfát és különösen kobalt-klorid hozzáadásával lehet kiegészíteni. Általában 23 és 38 C° közötti hőmérsékleten, előnyösen 35 C°-on állandó levegőztetés és percenkint 250-400 fordulatú állandó keverés közben fermentálunk. Ilyen körülmények között 2-4 nap alatt éljük el az antibiotikum termelés csúcsértékét. A fermentlé pH-ját általában 6,5 és 8,3 között, előnyösen 7,2-n tartjuk. Kis mennyiség, például 10 liter fermentálásakor a fermentlé pH-ját a beoltás után rendszerint nem szükséges újra beállítani. Nagyüzemi fermentáláskor azonban a fermentlé pH értékének növelésére vagy csökkentésére szükség lehet vegyszer hozzáadására. Erre e célra általánosan használt anyagok, például híg ásványi savak, híg lúgok, alkáliföldfémhidroxidok és -karbonátok stb. használhatók. A fermentálást általában két szakaszban hajtjuk végre; az egyik az egy vagy több lépésből álló csíráztató szakasz, utána következik a második, fermentáló szakasz. Általános szabály, hogy nagy mennyiségek/tartályokban való fermentálásakor két csíráztató szakaszt, és a rázólombikos fermentáláskor egyetlen csíráztató szakaszt alkalmazunk. A fermentálás folyamán, különösen az első 24 óra után a fermentléből alkalmas időközökben (például 6-8 óránként) mintát veszünk, hogy a termelés csúcsértékének elérését megállapíthassuk. Mikrobiológiai meghatározás A meghatározást szabványos korong-lemez próbával Difco No.5. antibiotikum-táptalajon Staphylococcus aureus ATCC 65538P mikroorganizmussal végezzük. A próba fizikai körülményei azonosak a neomicin vizsgálatára leírtakkal [Grove és Randall, Assay Methods of Antibiotics, Medical Encyclopedia Incorporated (1955) kiadása], A próbát 1000 jug/mg meghatározott hatékonyságú szabványos G-52 antibiotikumkészítménnyel összehasonlítva végezzük. A szabványmintának egy mikrogrammja a próbában 17,7 ±1,0 mm-es gátlási zónát hoz létre. A szabványos antibiotikum bázissal összehasonlítva a szabványos antibiotikumszulfát hatékonysága 675 Mg/mg. Amikor az antibiotikum-koncentráció csúcsértékét elértük, a terméket ismert műveletek, például megsavanyítás, szűrés, adszorpció, eluálás, liofilizálás stb. kombinálásával elkülönítjük. Egyik előnyös elkülönítési eljárásban az egész fermentlét megsavanyítjuk, előnyösen savval, rendszerint ásványi savval, és szűréssel vagy centrifugálással derítjük. Közömbösítés után az antibiotikum terméket alkalmas kationcserélő gyantán, például Amberlite IRC-50-en (karboxilcsoportokat tartalmazó térhálós metakrilsavszármazék) adszorbeáltatjuk, híg alkálilúggal, előnyösen ammóniumhidroxid-oldattal eluáljuk, és liofilizálással kinyerjük. Áz ilyen eljárással kapott termék a fermentálással termelt antibiotikumok összességét tartalmazza. Az antibiotikusan hatékony terméket úgy választjuk szét alkotórészeire, hogy a nyers liofilizátumot szilárd adszorbensen, például aluminiumoxidon, cellulózon, kovaföldön, magnéziumszilikáton vagy előnyösen kovasavgélen kromatografáljuk. Az eluálást ismert módszerekkel, bármely alkalmas poláris szerves oldószerrel vagy oldószerkeverékkel végrehajthatjuk. Amikor azonban szilárd adszorbensként kovasavgélt alkalmazunk, akkor előnyösen kloroform, izopropanol és tömény vizes ammóniumhidroxidoldat 2:1:1 térfogat/térfogat arányú keverékének alsó fázisával eluálunk. Ilymódon az antibiotikusan hatékony termék két főösszetevőre különül el, és még nem azonosított aktív anyagok nyoma is mutatkozik. Az oszlopból először eluált antibiotikum a G-52 antibiotikum, ezt követi a sziszomicin. Az antibiotikumok A fent leírt eljárással előállított sziszomicin ismert antibiotikum, 66-40 antibiotikumnak és rickamicinnek is nevezik: teljes szerkezete a Chemical Society, London, 1971 évi Chemical Communications című kiadványa 285. oldalán látható, ismertetik továbbá a 160 408 és 160 598 lajstromszámu magyar szabadalmi leírások. A sziszomicin biológiai tulajdonságait és előállítási eljárását a J. Antibiotics, Japan, 23, 11. sz., 551-565 közli. A G-52 antibiotikum és farmakológiailag elfogadható származékai kedvezőtlenül hatnak a Grampozitiv és Gram-negatív mikroorganizmusok növekedésére. Ennélfogva a G-52 antibiotikum és farmakológiailag elfogadható addiciós sói felhasználhatók in vivo vagy in vitro körülmények között az érzékeny baktériumok elpusztítására Vagy növekedésük gátlására. Az antibiotikumot és származékait felhasználhatjuk szappanokkal, mosószerekkel együtt a laboratóriumi felszerelés, sebészi műszerek, laboratóriumi üvegedények stb. felületéről az ilyen mikroorganizmusok eltávolítására vagy elpusztítására. Az antibiotikum és farmakológiailag elfogadható addiciós sói arra is használhatók, hogy emlős bacillusgazdákban, például egerekben, patkányokban, macskákban, kutyákban, szarvasmarhákban stb. az érzékeny mikroorganizmusokat elpusztítsuk vagy működésüket alaposan gátoljuk. A G-52 antibiotikum fehér szilárd anyag, vízben könnyen oldódik, és a legtöbb poláris oldószerben, például kevés szénatomos alkoholokban, di-/kevés szénatomos acil/-amidokban /ilyen a dimetilformamid/, di-/kevés szénatomos alkil/-szulfoxidokban / ilyen a dimetilszulfoxid/, piridinben stb. bizonyos mértékben szintén oldódik. Az antibiotikum Macllvaine-pufferoldatban 2-8 pH-nál és nátriumhidroxid-bórsav pufferoldatban 8-10 pH-nál 30 percig forralva nem bomlik el. Az antibiotikum az ultraibolya spektrum 220400 mfi tartományában nem mutat abszorpciót. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 •6./ ' 65 3
